VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 đối tượng nghiên cứu
- Vắc xin Ingelvac PRRS MLV (Vi rút PRRS chủng ATCC VR-2332) - Vắc xin PRRS nhược ựộc, chủng JXA 1-R do Trung Quốc sản xuất. - động vật thắ nghiệm: Lợn 3-4 tuần tuổi
3.2 địa ựiểm nghiên cứu
- Tại trại nuôi lợn Trạm kiểm tra năng suất lợn giống An Khánh Ờ Trung tâm kĩ thuật lợn giống Trung ương, tại xã An Khánh, Hoài đức, Hà Nội.
- Trại lợn của ông Nguyễn Bá Dư ở thôn Trung Tiến, Thụy Hương, Chương Mỹ, Hà Nội
- Tại Trung tâm chẩn ựoán thú y Trung ương.
3.3 Nội dung nghiên cứu
3.3.1 đánh giá tắnh an toàn của vắc xin PRRS nhập khẩu
Tiến hành tiêm cho lợn vắc xin phòng PRRS, sau ựó theo dõi các biểu hiện không bình thường so với trạng thái sinh lý của cơ thể.
3.3.2 đánh giá hiệu lực của vắc xin PRRS nhập khẩu
Tại thời ựiểm 21 ngày sau khi tiêm vắc xin, lợn thắ nghiệm ựược lấy máu xác ựịnh hàm lượng kháng thể PRRS bằng phương pháp ELISA (đánh giá ựáp ứng kháng thể), ựồng thời bắt ngẫu nhiện 05 lợn miễn dịch cùng với 03 lợn ựối chứng thử thách với vi rút PRRSV cường ựộc chủng NCVD PRRS- 07196 ( Chủng vi rút phân lập tại Việt Nam) tại Trung tâm ựể xác ựịnh:
3.3.2.1. Theo dõi triệu chứng lâm sàng, nhiệt ựộ ở lợn thắ nghiệm trước và sau khi công cường ựộc
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 36
3.3.2.3.Theo dõi tăng trọng của lợn thắ nghiệm
3.3.2.4. đánh giá mức ựộ bảo hộ của vắc xin sau khi công cường ựộc
3.3.2.5. đáp ứng miễn dịch trước và 21 ngày sau công cường ựộc bằng phương pháp ELISA và IPMA
3.3.2.6. Sự lưu hành của PRRSV trong huyết thanh lợn sau công cường ựộc
3.4 Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất
3.4.1 Vắc xin
3.4.1.1 Vắc xin Ingelvac PRRS MLV (Vi rút PRRS chủng ATCC VR-2332)
- Nhà sản xuất: Boehringer Ingelheim Vetmdica (Mỹ)
- Thành phần Khối lượng/liều ml
Vi rút PRRS chủng ATCC VR-2332 ≥1.05.7TCID50/liều Tá dược: Sucrose Gelatin (SGS)
Natri Clorid Solution 0,85% 25% - Chỉ ựịnh ựiều trị và liều dùng:
* Lợn nái, lợn cái con:2ml/tiêm bắp trước khi phối hoặc thời kỳ mang thai
* Lợn con:2ml/ tiêm bắp (cho lợn từ 3 tuần tuổi)
3.4.1.2 Vắc xin PRRS nhược ựộc, chủng JXA 1-R do Trung Quốc sản xuất
- Nhà sản xuất: Công ty TNHH thuốc thú y đại Hoa Nông (Trung Quốc)
- Thành phần Khối lượng/liều ml
Vi rút PRRS chủng JXA1 ≥105.0 TCID50/ liều
Tá dược: Skimmed milk Sucrose
120mg/ml 50 mg/ml - Chỉ ựịnh ựiều trị và liều dùng:
* Lợn nái, lợn cái con: tiêm phòng trước khi giao phối 30 ngày và sau khi ựẻ 14-20 ngày, mỗi lần tiêm 1 liều/con (2ml/liều)
* Lợn con: 2 tuần tuổi tiêm mũi ựầu tiên, 4 tháng sau tiêm mũi thứ 2, mỗi lần tiêm 1liều/con (2ml/liều)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 37
3.4.2 Vi rút PRRS ựộc lực cao Việt Nam
Vi rút NCVD PRRS- 07196 (Là chủng vi rút PRRS ựộc lực cao ựược phân tại Việt Nam năm 2007, vi rút ựược phân lập trên môi trường tế bào MARC- 145 và giữ ở ựiều kiện -700C)
3.4.3 động vật thắ nghiệm: Cho từng loại vắc xin
- Số lượng: 50 lợn 3-4 tuần tuổi, trọng lượng 6-8kg/con
- Tình trạng sức khỏe: Lợn khỏe mạnh và chưa sử dụng vắc xin phòng bệnh tai xanh(có kết quả xét nghiệm kiểm tra kháng thể âm tắnh)
3.4.4 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất
Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất của phòng thắ nghiệm thuộc Trung tâm chẩn ựoán thú y Trung ương.
3.4.5 Các nguyên vật liệu khác
- Chuồng trại, thức ăn, nước uống, chăm sóc và nuôi dưỡng: Theo ựiều kiện thực tế của trại lợn
- Vitamin B1, B-complex sử dụng trước và sau khi tiêm vắc xin.
3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Bố trắ thắ nghiệm: (Cho từng loại vắc xin)
Lô thắ nghiệm
Số
lượng Liều và ựường dùng
Phương pháp ựánh giá
Lô 1 (đối chứng)
10 Không dùng vắc xin Công cường ựộc, ELISA, IPMA. RT-PCR Lô2
(An toàn)
10 10 liều/lợn, tiêm bắp Theo dõi triệu chứng lâm sàng
Lô 3 (Miễn dịch)
30 01 liều/lợn, tiêm bắp Công cường ựộc, ELISA, IPMA. RT-PCR
3.5.2 Phương pháp ựánh giá tắnh an toàn của vắc xin
Theo dõi trong vòng 14 ngày sau khi tiêm vắc xin, ựánh giá kết quả. - Không có lợn chết trong thời gian theo dõi.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 38
- Không có những biểu hiện lâm sàng bất thường nào xảy ra do vắc xin trong thời gian khảo nghiệm.
- Không có phản ứng bất lợi nào xảy ra trong 2 giờ sau khi tiêm vắc xin và trong suốt 14 ngày sau khi tiêm vắc xin.
- Không có phản ứng cục bộ nào tại vị trắ tiêm trong thời gian theo dõi. - Tăng trọng của lợn không bị ảnh hưởng bởi vắc xin trên những lợn ựã ựược tiêm vắc xin.
3.5.3 Phương pháp ựánh giá hiệu lực của vắc xin sau khi công cường ựộc
để ựánh giá hiệu lực của vắc xin chúng tôi sử dụng 08 lợn ( 05 lợn ở lô miễn dịch và 03 lô ựối chứng). Lợn thắ nghiệm ựược chia nhóm và tiến hành tiêm vắc xin như sau:
Lịch tiêm vắc xin Nhóm lợn Lợn số
Liều tiêm Tuổi lợn Vị trắ tiêm
Miễn dịch 1, 2, 3, 4,
5 01 liều 3 tuần Bắp thịt sau gốc tai
đối chứng 6, 7, 8 Không tiêm vắc xin
Sau khi tiêm vắc xin hoàn tất, chúng tôi tiến hành bắt lợn ựã chọn về trung tâm Chẩn ựoán thú y TW chuẩn bị công cường ựộc.
Lợn thắ nghiệm ựược ựưa về Trung tâm, ựược nuôi thắch nghi trong 3 ngày trước khi công cường ựộc. Mỗi lợn ựược tiêm 1ml huyễn dịch chứa 106 TCID50 PRRSV chủng ựộc lực cao NCVD PRRS- 07196. Thời gian theo dõi lợn sau khi công cường ựộc là 21 ngày. Công việc cụ thể như sau:
- Theo dõi biến ựổi lâm sàng - Hàng ngày (cả sáng và chiều)
- đo nhiệt ựộ - Hàng ngày (ựo vào buổi sáng từ 7-9 giờ)
- Lấy máu ựếm bạch cầu - Ngày 0, 4, 7, 10, 14, 21 sau công cường ựộc - Lấy máu kiểm tra kháng thể
- Lấy máu kiểm tra vi rút huyết - Ngày 0, 4, 7, 14, 21 sau công cường ựộc - Mổ khám kiểm tra bệnh tắch, lấy
bệnh phẩm xác ựịnh PRRSV.
- Khi lợn chết hoặc khi kết thúc thắ nghiệm mà lợn không chết.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 39
3.5.3 Phương pháp ựếm bạch cầu
Bạch cầu là những tế bào máu có vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ cơ thể nhờ chức năng thực bào và chức năng miễn dịch. Do ựó sự biến ựộng số lượng bạch cầu của lợn thắ nghiệm là một chỉ tiêu quan trọng.
* Nguyên liệu cần sử dụng là:
- Acid acetic 1% (1ml acid acetic trong 99 ml nước khử ion). Sau khi pha bảo quản ở nhiệt ựộ phòng.
- Chất chống ựông.
- Buồng ựếm Newbauer: - Kắnh hiển vi
* Các bước chuẩn bị:
+ Lấy máu cho vào ống efpendof có chứa chất chống ựông EDTA. + Trộn ựều mẫu máu bằng máy vortex.
+ Cho 100 ộl máu vào ống efpendof có chứa 900 ul acid acetic. + Trộn ựều hỗn hợp bằng máy vortex.
* Cách ựếm bạch cầu:
+ Trộn ựều hỗn hợp trong ống efpendof một lần nữa
+ đặt lamen lên buồng ựếm Newbauer nhỏ mẫu máu vào buồng ựếm sao cho mẫu vừa láng ựều trên buồng ựếm.
+ đếm bạch cầu ở 4 ô vuông lớn ở 4 góc rồi lấy trung bình
Công thức tắnh:
Số lượng bạch cầu/ộl máu = Số bạch cầu ựếm ựược x 100/1ộl máu
(đơn vị ộl máu tương ựương với mm3 máu)
3.5.4 Phương pháp ELISA gián tiếp