c. Các bước tiến hành
3.5.5 Phương pháp IPMA
IPMA sử dụng ựể phát hiện kháng thể nghi hoặc kháng nguyên nghi. Trong thắ nghiệm này chúng tôi sử dụng IPMA ựể phát hiện kháng thể nghi.
* Nguyên lý:
Thực chất của phản ứng này là kháng nguyên kết hợp với kháng thể giống như phương pháp ELISA.
Nguyên liệu, dụng cụ và hoá chất cần dùng a. Thiết bị:
- Buồng cấy an toàn sinh học cấp ựộ 2 - Kắnh hiển vi ựảo chiều.
- Máy hút chân không, máy li tâm lạnh, máy khuấy từ và que khuấy từ - Cân ựiện tử chắnh xác ựến 4 ựơn vị.
- Tủ lạnh, tủ mát, tủ ấm thường, tủ ấm CO2, tủ sấy - Nồi ựun cách thuỷ, nồi hấp
- Một số thiết bị khác ựể bảo quản và nuôi cấy tế bào.
b. Dụng cụ
- Chai thuỷ tinh, cốc thuỷ tinh các kắch cỡ 100, 200, 500, 1000 ml - Pipet thuỷ tinh 1,5 và 10 ml
- Micropipet ựơn, Micropipet nhiều ựầu
- Dụng cụ nuôi cấy tế bào chai nhựa Flask T75, ựĩa nhựa 96, 24, 6 giếng. - ống Falcon ựáy vát.
c. Hoá chất
- Môi trường EMEM với 5% FCS (Fetal calf serum - huyết thanh thai bê) - Dung dịch A: Dung dịch cố ựịnh tế bào, gồm: PBS có 10% Formalin và 1% NP40.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 43
- Dung dịch B: Dung dịch nước rửa, gồm PBS với 1% Tween 80
- Dung dịch C: Dung dịch pha loãng mẫu, gồm PBS 1% Tween 80 và 5% sữa gầy
- Dung dịch E: Dung dịch AEC, gồm 1ml AEC + 14 ml Acetate buffer 0, 1 M (PH 5,2 ) + 15 ộl H202 30%.
d. Môi trường tế bào MARC 145
e. Giống vi rút cường ựộc: Kắ hiệu NCVD PRRS- 07196 ( là chủng vi rút PRRS ựộc lực cao ựược phân tại Việt Nam năm 2007, vi rút ựược phân lập trên môi trường tế bào MARC- 145.
Cách tiến hành
* Bước 1: Chuẩn bị tế bào MARC -145 vào ựĩa 96 giếng.
+ Sau khi ống tế bào MARC- 145 ựựng trong cryotube ựược ựưa ra khỏi bình nitơ lỏng, nhanh chóng ựược giải ựông rồi cho vào ống Falcon 15 có chứa sẵn 10 ml dung dịch EMEM 5% FCS. Trộn ựều và ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Hút nước trong ở trên bỏ ựi, cho tiếp vào 5ml dung dịch EMEM 5% FCS trộn ựều. Hút dung dịch này cho vào chai Flask T75. để vào tủ ấm CO2 khoảng 24 h ựưa ra quan sát dưới kắnh hiển vi ựảo chiều, xem sự phát triển của tế bào. Thay dung dịch phát triển 1 ngày 1 lần. Trong khoảng 2- 4 ngày sẽ thu ựược một thảm tế bào. Thường thu tế bào khi ựã phát triển chiếm hết 90% diện tắch chai Flask.
+ Thu tế bào và chia ựều vào ựĩa 96 giếng. Mỗi giếng cho 100ộl.
+ ủ ựĩa tế bào trong tủ ấm 370C từ 1- 2 ngày cho tế bào trong giếng phát triển thành một lớp ở ựáy giếng.
* Bước 2: Gây nhiễm PRRSV.
+ Lấy dung dịch vi rút từ nơi bảo quản, giải ựông nhanh rồi ựem chuẩn ựộ, rồi pha loãng vi rút sao cho có 500 TCID50 vi rút/ml.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 44
+ ủ ựĩa trong tủ ấm CO2 trong 2 ngày. * Bước 3: Cố ựịnh tế bào nhiễm. + đổ dung dịch nuôi dưỡng
+ Cho vào mỗi giếng 100 ộl dung dịch A + ủ ở nhiệt ựộ phòng khoảng 30 phút + Rửa ựĩa bằng dung dịch rửa B 2 lần.
* Bước 4: Cho kháng thể lần 1 là kháng thể cần kiểm tra
+ đối với phản ứng chỉ ựịnh tắnh ựể biết âm hay dương chỉ cần pha loãng huyết thanh ở mức 1/160.
+ đối với phản ứng ựịnh lượng pha theo cơ số 2 bắt ựầu từ 1/10. + Cho 50 ộl huyết thanh cần kiểm tra vào các giếng.
+ ủ ựĩa ở 370C trong 30 phút. + Rửa ựĩa 3 lần bằng dung dịch B.
* Bước 5: Cho kháng thể lần 2- Kháng kháng thể có gắn enzyme peroxidase.
+ Pha loãng kháng thể lần 2 với dung dịch nước rửa theo tỷ lệ 1/600. + Cho vào mỗi giếng 50 ộl kháng thể lần 2 ựã pha loãng.
+ ủ ở 370C trong 30 phút
+ Rửa ựĩa 3 lần bằng dung dịch rửa B * Bước 6: Cho cơ chất:
+ Cho vào mỗi giếng 50 ộl dung dịch AEC- dung dịch E + ủ ở nhiệt ựộ phòng 30 phút
* Bước 7: đọc kết qủa:
để ựọc kết quả sử dụng kắnh hiển vi ựảo chiều.
Giếng nào quan sát thấy thảm tế bào có những ựám tế bào bắt màu ựỏ ựậm, thì mẫu huyết thanh cho vào giếng có kháng thể PRRS.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 45
Giếng nào quan sát thấy toàn bộ thảm tế bào có màu hồng nhạt của dung dịch EMEM 5% FCS, thì mẫu huyết thanh cho vào giếng ựó không có kháng thể PRRS.