c. Các bước tiến hành
3.5.6 Phương pháp Realtime RT-PCR
đây là phương pháp có ựộ chắnh xác rất cao, dùng ựể phát hiện sự có mặt của PRRSV trong huyễn dịch, huyết thanh và dịch nổi. Nó ựược áp dụng ựể xét nghiệm, chẩn ựoán bệnh ựộng vật thuộc Cục Thú y.
3.5.6.1 Máy móc, nguyên liệu
Hệ thống chiết tách RNA Máy Realtime PRC
Bộ Micropipette các kắch cỡ
Kắt RT-PCR: Qiagen One-step RT-PCR Kit (Cat No.210210) Primer và Probe
Modification Tên Primer/Probe Sequence (5Ỗ-3Ỗ)
5Ỗ 3Ỗ
Probe TGT GGT GAA TGG CAC
TGA TTG ACA FAM BHQ1
Forward ATG ATG TGC TGG CAT TCT None None
PRRS-1 (NA)
Reverse ACA CGG TCG CCC TAA TTG None None
3.5.6.2 Cách tiến hành
a. Chiết tách RNA.
+ Chuẩn bị dung dịch Buffer RTL, dung dịch này lấy ra từ bộ kit phải bổ sung thêm β-Mercaptoethanol theo tỷ lệ 1/100. Chuẩn bị sẵn ống 1,5 ml có chứa 600 ộl dung dịch RTL ở trên.
+ Lắc ựều mẫu bằng máy Vortex trong 5 giây, rồi ly tâm bằng máy Spindown ựể mẫu ở xung quanh xuống hết.
+ Chuyển vào ống 1,5 ml có chứa dung dịch RTL ở trên 200 ộl (ựối với huyễn dịch tổ chức), 50 ộl ựối với huyết thanh, viết ký hiệu mẫu vào
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 46
thành ống.
+ Lắc ựều bằng máy Vortex trong 15 giây, sau ựó ly tâm bằng máy spindown.
+ Cho vào 40 ộl cồn Ethanol 100% (ETOH) tiến hành lắc và ly tâm. + Ly tâm 1000 vòng trong 1 phút
+ Cho dịch nổi của mẫu vào hệ thống cột RNeasy Qiagen, hút chân không cho dịch nổi xuống hết.
+ Cho vào cột Rneasy Qiagen 700 ộl nước rửa 1 (RW1) + Cho thêm 2 lần nước rửa 2 vào cột, mỗi lần 500 ộl. + Chuyển cột vào ống thu mới.
+ Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút.
+ Cho vào ống 500 ộl RNase- Free H2O chờ 1 phút. + Ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút ựể thu RNA b. Chuẩn bị Master mix
Qiagen one-step RT-PCR kit
Reagent Lượng (ộl)
DW (De ionized water) 10.5
5x Reaction Mix 5.0
MgCl2 (25mM) 1.2
dNTP 0.8
Primer and probe 1.5
Enzyme mix 1.0
Cho 20 ộl master mix vào ống PRC. Cho 5 ộl mẫu RNA vào ống PRC.
đặt ống PRC vào máy Realtime PCR machine. Chạy chương trình.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 47
c. Chạy phản ứng.
Qiagen One-step RT-PCR kit
RT (reverse transcription) PCR (polymerase chain reaction) Nhiệt ựộ Thời gian Số chu kỳ Nhiệt ựộ Thời gian Số chu kỳ
500 C 30 phút 950 C 10 giây
950 C 15 phút 1 600 C 60 giây 40
3.5.6.3 đọc kết quả
Xét nghiệm ựược công nhận khi:
+ đối chứng dương tắnh cho giá trị Ct ựã biết (ổ 2). + đối chứng âm tắnh không có Ct.
+ Mẫu ựược coi là dương tắnh khi có Ct ≤ 35. + Mẫu ựược coi là âm tắnh nếu không có Ct. + Mẫu ựược coi là nghi ngờ nếu có Ct > 35