- Trong thiên nhiên, virus xâm nhập qua đường hơ hấp, tiêu hố, qua các vết thương. Ngồi ra, đường sinh dục là đường xâm nhập phụ.
- Trong phịng thí nghiệm, đường tiêm nội bì cĩ hiệu quả nhất. Với bị và lợn, người ta hay tiêm virus vào nội bì niêm mạc lưỡi, với chuột lang, tiêm vào nội bì gan bàn chân. Những đường tiêm khác như tiêm bắp thịt, dưới da, tĩnh mạch cho kết quả khơng chắc chắn và địi hỏi liều virus cao hơn.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 30
2.3.4. Cơ chế sinh bệnh
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978) [9], virus LMLM cĩ tính hướng thượng bì, sinh sản chủ yếu trong các tế bào thượng bì niêm mạc và da, phần lớn là ở những tế bào thượng bì non. Khi virus xâm nhập vào cơ thể, nĩ nhân lên trước tiên ở trong lớp thượng bì của nơi xâm nhập. Trong quá trình nhân lên ở đây, virus gây huỷ hoại các tế bào thượng bì và hình thành mụn nước sơ phát. Sau đĩ, virus chứa trong dịch lâm ba và sẽ tiến vào máu, phủ tạng. Khi virus vào máu sẽ gây sốt, cuối giai đoạn sốt, virus nhân lên và gây ra các mụn nước thứ phát ở nơi những tế bào thượng bì đang phân chia mạnh như niêm mạc, xoang miệng, vành mĩng, kẽ mĩng, đầu vú bị sữa, mõm lợn. Mụn nước phát triển to dần ra, nhơ lên nhưng khơng bao giờ sinh mủ khi khơng cĩ vi trùng kế phát.
Sau khi mụn vỡ, những vết tích trên thượng bì được lấp bằng nhanh chĩng, khơng để lại sẹo do tế bào của lớp Manpighi vẫn nguyên vẹn. Mụn nước chỉ loét khi nhiễm khuẩn kế phát, vi khuẩn sinh mủ, gây hoại tử xâm nhập gây bệnh lý cục bộăn sâu vào trong, cĩ khi gây bại huyết, con vật cĩ thể chết.
2.4. CÁC BIỂU HIỆN ðẶC TRƯNG CỦA BỆNH LMLM 2.4.1. Triệu chứng lâm sàng
- Ở trâu bị: Sau một thời gian nung bệnh từ 3 – 6 ngày, triệu chứng đầu tiên là gia súc sốt cao 40- 410 C kéo dài trong 2 đến 3 ngày. Sau đĩ, nhiệt độ cơ thể hạ xuống, con vật hay nhai lại, tiết nhiều nước bọt, hay chép miệng, niêm mạc miệng, lợi và lưỡi hình thành mụn nước bên trong, mụn lan nhanh ra ngồi mơi và trên bề mặt lưỡi, xung quanh lợi và đặc biệt ở trên phần lợi giả của hàm trên và đầu lưỡi. ðồng thời với mụn nước ở miệng, mụn nước ở chân cũng xuất hiện, đặc biệt là ở kẽ mĩng và vành mĩng.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 31
Nếu cĩ sự xâm nhập của vi khuẩn kế phát vào bệnh tích sẽ làm cho vết thương nặng hơn và gây trở ngại cho việc điều trị. Sảy thai và vơ sinh là hậu quả phổ biến, sản lượng sữa giảm và thậm chí gây lên viêm vú. Gia súc non mẫn cảm hơn gia súc trưởng thành, bê, nghé cĩ tỷ lệ chết cao, cĩ thể chết mà khơng cĩ triệu chứng điển hình.
- Ở lợn: Thời gian nung bệnh từ 2- 12 ngày, nhiều triệu trứng lâm sàng giống như lồi nhai lại. ðầu tiên lợn cĩ biểu hiện đi lại khĩ khăn, khập khiễng hoặc khơng muốn di chuyển, hay nằm hoặc ngồi bằng khớp chân trước. Con vật kém ăn hoặc bỏ ăn, cĩ hoặc khơng chảy nước dãi. Mụn nước nổi nên quanh mũi, sống mũi, niêm mạc miệng (thường khơng phổ biến), đầu vú hay quanh bầu vú.
Trên lợn, các triệu chứng lâm sàng của LMLM khơng thể phân biệt được với các bệnh cĩ mụn nước khác như viêm miệng mụn nước, ngoại ban cĩ mụn nước, và các bệnh mụn nước ở lợn (Callis, P.D Kercher, 1986) [18].
2.4.2. Bệnh tích
Bệnh tích bên trong chủ yếu là hoại tử các cơ bắp, trong đĩ chủ yếu là cơ tim tạo ra cái gọi là tim vằn hổ. Khi mổ động vật, chúng ta thấy mặt ngồi của tim cĩ các vết xuất huyết cĩ vệt như da hổ nên gọi là tim vằn hổ. ðây là bệnh tích cĩ ý nghĩa quan trọng trong việc
kiểm sốt giết mổ. Hình 2.2. Tim vằn hổ Nếu nặng gia súc cĩ thể bị chết. Tỷ lệ chết cao thường thấy ở gia súc non. Khi con vật chết do biến chứng thì thấy các bệnh tích mưng mủ, hoại tử, nhất là ở các ngĩn chân, thối xương, thối gân. Nếu khơng bị bội nhiễm
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 32
hoặc biến chứng thì dần dần gia súc hồi phục nhưng cịn để lại các di chứng là các vết sẹo ở miệng, vú, vành mĩng.
2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ðỐN BỆNH LMLM
Việc xác định chính xác bệnh LMLM là quan trọng bậc nhất ở tất cả các nước, ngay cả những nước cĩ dịch địa phương hoặc những nước, những vùng thực tế khơng cĩ bệnh. Phát hiện sớm ra bệnh gĩp phần quan trọng trong việc đưa ra các biện pháp khống chế và tiêu diệt bệnh và giảm thiệt hại do bệnh gây nên. Việc xác định các serotype, subtype gây bệnh LMLM ở các vùng, các địa phương cĩ ý nghĩa quyết định trong chương trình phịng chống bệnh bằng vacxin.
Theo các tác giả J.B Brooksby (1982) [17], J.I Callis và P.D.Mc Kercher (1986) [18], Dimitradis I (1991) [20], Ferris N.P và cộng sự (1988) [21], Have P. (1987) [24], Kitching P. (1989) [27] và nhiều tác giả khác thì việc chẩn đốn, xác định bệnh LMLM bằng các phương pháp sau:
2.5.1. Chẩn đốn lâm sàng
Việc chẩn đốn lâm sàng bệnh LMLM cĩ thể thực hiện trong trường hợp bệnh xảy ra tại khu vực đã được xác định là cĩ dịch LMLM. Các triệu chứng của bệnh là sự xuất hiện các mụn nước trong khoang miệng (lưỡi, lợi), quanh mũi, vành tiếp giáp da với mĩng chân, kẽ chân và các đầu vú (đối với bị sữa). Kèm theo các triệu chứng trên là hiện tượng con vật bị què do bịđau chân gây khĩ khăn trong khi di chuyển.
ðối với lợn da trắng, cĩ thể xuất hiện các vệt đen trên mĩng chân màu trắng. Thơng thường lợn mắc bệnh thường dễ bị tụt mĩng chân hơn bị. Tuy nhiên, việc chẩn đốn lâm sàng thường dễ bị nhầm với các bệnh khác như: Viêm miệng mụn nước, bệnh mụn nước ở lợn, bệnh ngoại ban (exantheme),
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 33
bệnh dịch tả trâu bị, bệnh tiêu chảy do siêu trùng ở bị... Mặc khác cần phải chú ý rằng khơng phải tất cả số gia súc mắc bệnh đều cĩ biểu hiện lâm sàng rõ rệt. Do vậy, cần kết hợp với số liệu dịch tễđể chẩn đốn.
2.5.2. Chẩn đốn phịng thí nghiệm
Tại những nơi chưa bao giờ xảy ra dịch LMLM, triệu chứng lâm sàng chỉ cĩ tính chất định hướng trong chẩn đốn và nhất thiết phải dùng biện pháp chẩn đốn bằng xét nghiệm trong phịng thí nghiệm để khẳng định bệnh.
Bệnh phẩm thích hợp để phân lập virus LMLM là chất biểu mơ và dịch tiết ở các mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ. Lượng tối thiểu phải từ 3-5 g tổ chức tươi. ðể phát hiện kháng thể thì bệnh phẩm là máu những con nghi mắc bệnh với lượng 3-5 ml, để máu đơng chắt lấy huyết thanh. Bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
2.5.2.1. Chẩn đốn virus học
Dùng huyễn dịch bệnh phẩm (mụn nước, biểu mơ...) nuơi cấy trên tế bào mẫn cảm (tế bào thận bê, BHK- 21...), tiêm cho động vật thí nghiệm (chuột lang, bê vv..), tiêm nội bì lưỡi bị trưởng thành, rồi theo dõi sự biến đổi của tế bào hoặc triệu chứng, bệnh tích của động vật thí nghiệm, để xác định bên trong bệnh phẩm cĩ chứa virus LMLM khơng.
2.5.2.2. Chẩn đốn bằng phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT)
Phản ứng KHBT được thực hiện nhờ hệ thống dung huyết và hệ thống dung khuẩn với sự tham gia bổ thể. Bởi vì, sự dung khuẩn mắt thường khơng nhìn thấy được, do vậy phải dùng hệ thống dung huyết để đánh giá kết quả qua quan sát bằng mắt thường.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 34
2.5.2.3.Chẩn đốn bằng các phản ứng trung hồ virus
Trong cơ thể động vật mắc bệnh, virus gây bệnh kích thích sản sinh ra kháng thể tương ứng, kháng thể này cĩ khả nămg trung hồ chính virus kích thích sinh ra nĩ, làm virus khơng cịn khả năng gây bệnh thí nghiệm và phá huỷ tế bào mẫn cảm.
Căn cứ vào cĩ hay khơng cĩ sự biến đổi tế bào sau khi cấy hỗn hợp kháng nguyên – kháng thể, để xác định con vật khơng hay cĩ bị bệnh và bị bệnh do type virus LMLM nào.
Phản ứng trung hồ virus thường rất nhạy và đặc hiệu, chỉ cần 2- 3 ngày là cĩ kết quả nhưng nếu lượng huyết thanh ít, hiệu giá thấp, dương tính giả cĩ thể xảy ra.
2.5.2.4. Chẩn đốn bằng phản ứng ELISA
ðây là một phương pháp cĩ độ nhạy và độ chính xác cao (Crowther, Abu Elzein, 1979) [19], (Hamblin và cs, 1987) [22], Have và cs, 1983) [23], Roeder và Le Blanc Smith, 1986) [29].
a. Nguyên lý:
Phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vào. Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym khơng bị rửa trơi, enzym sẽ phân giải cơ chất tạo lên màu, khi cĩ màu trong quang phổ kế thì sẽ định lượng được mức độ phản ứng.
b. Phân loại phản ứng ELISA: được phân thành ba loại chính như sau
- Phản ứng ELISA trực tiếp (direct ELISA): dùng kháng thể gắn enzym để xác định kháng nguyên nghi cốđịnh trên đĩa chuyên dụng.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 35
- Phản ứng ELISA gián tiếp (indirect ELISA): dùng kháng nguyên chuẩn và kháng kháng thể gắn enzym để phát hiện kháng thể nghi.
- Phản ứng Sandwich ELISA gồm 2 loại:
+ Phản ứng Sandwich ELISA trực tiếp (direct Sandwich ELISA): kháng nguyên chuẩn được kẹp giữa kháng thể chuẩn và kháng thể gắn emzym.
+ Phản ứng Sandwich ELLISA gián tiếp (indirect Sandwich ELISA): kháng nguyên chuẩn được được kẹp giữa kháng thể chuẩn và kháng thể nghi, sau đĩ kháng thể nghi được nhận diện bằng kháng kháng thể lồi gắn enzym.
c. Ứng dụng phản ứng ELISA trong chẩn đốn bệnh LMLM:
Phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên virus LMLM:
Phương pháp ELISA thường được sử dụng để xác định sự cĩ mặt của kháng nguyên virus LMLM trong mẫu bệnh phẩm lấy từ gia súc bị nghi ngờ nhiễm virus.
Kháng nguyên của virus LMLM cĩ thể xác định bằng phương pháp ELISA trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm biểu mơ hay dịch tiết ở các mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ.
Cịn mẫu được lấy từ nơi chứa ít virus hay chất lượng mẫu khơng đảm bảo thì trước khi định type virus bằng phương pháp ELISA sẽ tiến hành nuơi cấy virus trên mơi trường tế bào sau đĩ phân lập virus từ mơi trường nuơi cấy.
Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng virus LMLM:
Phương pháp ELISA cũng được sử dụng để phát hiện và giám định các serotype của virus LMLM trong huyết thanh gia súc. Trong phản ứng, mỗi đĩa ELISA chỉ làm với một type virus LMLM chuẩn, để phát hiện kháng thể nghi trong huyết thanh của gia súc cần chẩn đốn.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 36
Cĩ thể sử dụng cả ba phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus LMLM. Nhưng hiện nay phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp thường được sử dụng phổ biến hơn cả. Bởi vì, kĩ thuật ELISA này cĩ thuận lợi hơn hẳn các phản ứng thơng thường khác do cĩ tính đặc hiệu rất cao, rất nhạy lại kinh tế vì nhiều ứng dụng:
- Trong chẩn đốn phát hiện bệnh, với phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp chúng ta cĩ thể phát hiện và định type kháng nguyên virus LMLM từ mẫu bệnh phẩm biểu mơ, dịch tiết hay cĩ thể phát hiện kháng thể và giám định serotype virus LMLM từ mẫu bệnh phẩm huyết thanh.
- ðối với gia súc đã tiêm phịng vacxin, đểđánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của gia súc sau tiêm phịng cũng như hiệu quả sử dụng vacxin người ta cũng sử dụng phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp để định lượng kháng thể kháng virus LMLM.
Phương pháp LPB - ELISA (Liquid Phase Blocking ELISA)
Trong chẩn đốn huyết thanh học, phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp được sử dụng nhiều nhất hiện nay trên thế giới là phương pháp LPB - ELISA (Liquid Phase Blocking ELISA). Phương pháp này được nghiên cứu và đưa ra lần đầu tiên bởi Hamblin và cộng sự vào năm 1986. ðộ nhậy của phản ứng LPB - ELISA tương đương với phản ứng trung hồ virus nhưng lại khơng phải nuơi cấy tế bào trong xét nghiệm. Do đĩ, đây là một phương pháp xét nghiệm hiệu quả, an tồn và ít tốn kém hơn so với phương pháp trung hồ virus rất nhiều.
Kỹ thuật chẩn đốn này cho kết quả nhanh trong vịng 3 – 4 giờ, khơng phụ thuộc mơi trường mơ, tỷ lệ phần trăm dương tính giả thấp. Do cĩ thể sử dụng kháng nguyên vơ hoạt nên xét nghiệm được với số lượng chủng virus nhiều hơn.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 37
Hiện nay, để thuận lợi cho việc chẩn đốn tại các phịng thí nghiệm, người ta đã sản xuất ra các bộ KIT chẩn đốn dựa trên kỹ thuật LPB - ELISA. Các thành phần và nguyên liệu cho phản ứng vẫn cĩ thể thực hiện được xét nghiệm dễ dàng. Cĩ hai loại bộ KIT đã được sản xuất là bộ KIT LPB - ELISA bao gồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện 7 serotype virus và bộ KIT LPB - ELISA phát hiện 3 hoặc 4 serotype virus LMLM. Hiện bộ KIT LPB - ELISA chẩn đốn đang được sử dụng tại Việt Nam gồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện 4 serotype virus O, A, C và Asia1.
d. Ứng dụng phương pháp NSP – ELISA (Non Structural Protein ELISA) Trong chẩn đốn phân biệt kháng thể trong huyết thanh của gia súc do bị nhiễm virus LMLM tự nhiên với kháng thể trong huyết thanh của gia súc do tiêm phịng vacxin
Phương pháp NSP - ELISA dựa trên nguyên lý sau: Sau khi virus LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra. Trong quá trình này, virus vừa tạo ra các thành phần để tái tạo thành các hạt virus mới, vừa tạo ra các thành phần khơng tham gia kết hợp thành các hạt virus mới mà chỉ đĩng vai trị các men giúp cho quá trình nhân lên. Các thành phần kết hợp thành bản thân các hạt virus cĩ tính kháng nguyên gọi là kháng nguyên cấu trúc (SP). Các thành phần khơng tham gia kết hợp thành các hạt virus mới cĩ tính kháng nguyên gọi là kháng nguyên khơng cấu trúc (NSP).
Trong đĩ một số kháng nguyên khơng cấu trúc cĩ khả năng kích thích gia súc tạo ra kháng thể với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh gia súc (nhất là trâu bị) đã nhiễm bệnh. Cịn gia súc được tiêm phịng vacxin, đặc biệt những vacxin vơ hoạt cĩ độ tinh khiết cao (đã được loại bỏ những kháng nguyên khơng cấu trúc) sẽ chỉ sản sinh kháng thể khơng đặc hiệu chống virus LMLM chứ khơng cĩ kháng thể kháng lại kháng nguyên khơng
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 38
cấu trúc. Vì vậy, việc phát hiện kháng thểđặc hiệu kháng kháng nguyên khơng cấu trúc cho phép kết luận gia súc đang bị nhiễm virus LMLM.
Phương pháp NSP – ELISA được sử dụng chẩn đốn cho nhiều loại gia súc như trâu bị, dê, cừu. Kháng nguyên khơng cấu trúc xuất hiện sớm