a. Cơ sở khoa học
Khi virus LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc móng guốc chẵn, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra. Trong quá trình này, virus vừa tạo ra các thành phần ñể tái tạo các hạt virus mới (các virion), vừa tạo ra các thành phần không tham gia tạo thành các hạt virion mới mà chỉ ñóng vai trò các men giúp cho quá trình nhân bản. Các thành phần kết hợp thành bản thân virus có tính kháng nguyên gọi là protein cấu trúc (structure protein). Các thành phần không tham gia kết hợp thành virion mới và có tính kháng nguyên gọi là protein không cấu trúc (non-structure protein).
Trong các protein không cấu trúc của virus LMLM thì kháng nguyên 3ABC có tính kháng nguyên rất cao, nó kích thích cơ thể gia súc tạo ra kháng thể ñặc hiệu với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bò bị nhiễm. Do ñó việc phát hiện kháng thể ñặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc ñang bị nhiễm virus LMLM.
Hiện nay nước ta ñang sử dụng vacxin LMLM nhập từ hãng Intervet (Hà Lan) và Merial (Pháp). Những loại vacxin này là vô hoạt và ñã loại bỏ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 48
những kháng nguyên không cấu trúc. Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt virus) chứ không có kháng thể kháng lại kháng nguyên không cấu trúc 3ABC. Do ñó, dùng phản ứng ELISA sẽ phát hiện ñược trâu bò nhiễm virus LMLM, kể cả những trâu bò ñã ñược tiêm phòng.
b. Sơ ñồ ñĩa phản ứng CHEKIT FMD – 3ABC – BO – OV dùng cho huyết thanh trâu bò.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N N 13 B P P 14 C 1 7 15 D 2 8 E 3 9 F 4 10 G 5 11 H 6 12 Chú thích:
N: huyết thanh ñố chứng âm P: Huyết thanh ñối chứng dương 1, 2, ..., 92: huyết thanh cần kiểm tra
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 49
c. Các bước tiến hành: Bước 1: Gắn mẫu vào ñĩa
- Pha loãng mẫu huyết thanh cần kiểm tra và huyết thanh ñối chứng với dung dịch pha loãng mẫu ñã chuẩn bị (sample – diluent) theo tỉ lệ 1:100.
- Nhỏ vào mỗi giếng 100µl huyết thanh cần kiểm tra và huyết thanh ñối chứng (âm, dương) ñã pha loãng theo sơ ñồñĩa phản ứng.
- ðậy nắp, cho ñĩa vào trong hộp ẩm và ñặt vào tủ ấm, ủ ñĩa ở 370C trong 1 giờ.
- Phức hợp kháng nguyên 3ABC – Kháng thể 3ABC sẽ ñược tạo thành nếu trong huyết thanh kiểm tra có kháng thể 3ABC.
Bước 2: Rửa ñĩa ELISA
Sau 1 giờủ, lấy ñĩa ra và tiến hành rửa ñĩa 3 lần bằng máy rửa ñể loại bỏ hết phần kháng thể 3ABC thừa. Mỗi lần rửa cần nhỏ ít nhất vào mỗi giếng 300 µl dung dịch nước rửa ñã pha loãng, tránh tạo các bọt khí trong quá trình rửa. Sau khi rửa, ñập nhẹ ñĩa lên giấy thấm ñể các giếng khô hết. Không ñể các giếng ñã khô trong một thời gian dài trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
Bước 3: Gắn Conjugate
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ñĩa, mỗi giếng 100µl Conjugate.
- ðậy nắp, cho ñĩa vào trong hộp ẩm và ñặt vào tủ ấm, ủ ñĩa ở 370C trong 1 giờ.
- Sau 1 giờ lấy ñĩa ra và tiến hành rửa ñĩa như bước 2 ñể loại bỏ hết Conjugate thừa
Bước 4: Gắn Substrate TMB
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 50
Trước khi tiến hành bước 4, Substrate TMB ñược làm ấm ở 250C. Sau ñó nhỏ vào tất cả các giếng của ñĩa, mỗi giếng 100µl Substrate TMB.
- ðể ñĩa ở nhiệt ñộ phòng trong 15 – 20 phút.
Bước 5: Dừng phản ứng
Trước khi tiến hành bước 5, dung dịch dừng phản ứng (stopping solution) ở nhiệt ñộ bảo quản 1 – 80C ñược làm ấm ở 18 – 250C. Nhỏ vào tất cả các giếng của ñĩa, mỗi giếng 100µl dung dịch dừng phản ứng.
Bước 6: ðọc kết quả phản ứng
ðọc kết quả phản ứng trên máy ñọc ELISA Titertek Multiskan Plus MKII, kính lọc 450nm. Kết quả phản ứng ñược phân tích dựa trên sự so sánh giá trị OD của huyết thanh ñối chứng và OD của huyết thanh kiểm tra theo công thức sau:
ODM - ODN
Value (% ) = X 100% ODP - ODN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ODM: giá trị OD của mẫu huyết thanh kiểm tra. ODN : giá trị OD của mẫu huyết thanh ñối chứng âm. ODP : giá trị OD của huyết thanh ñối chứng dương.
Giá trị (%) < 20% 20% - 30% > 30% Kết quả Âm tính Nghi ngờ Dương tính
Khi kết quả xét nghiệm là dương tính, chúng ta kết luận trong huyết thanh của trâu bò kiểm tra có kháng thể kháng virus LMLM do nhiễm virus tự nhiên. Như vậy, kết luận trâu bò kiểm tra ñã bị nhiễm virus LMLM. Với
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 51
những mẫu nghi ngờ cần lấy máu xét nghiệm lại sau 15 ngày.
d. Sơ ñồ ñĩa phản ứng CHEKIT FMD – 3ABC – BO – PO dùng cho huyết thanh lợn.
Tương tự như sơ ñồ phản ứng cuả CHEKIT FMD – 3ABC – BO – OV chỉ khác ở ñộ pha loãng mẫu huyết thanh của lợn là 1:10. Và ñọc kết quả ở bước sóng 405nm. Còn các bước tiến hành phản ứng thì tương tự.