Khi sử dụng vacxin cho gia súc, luôn phải kiểm tra xem vacxin ựó có cùng subtype với virus gây bệnh tại nơi ựó không. Việc kiểm tra serotype và subtype trong thời kỳ dịch là bắt buộc vì virus LMLM thay ựổi thường xuyên trong quá trình tiếp ựời tự nhiên trên rất nhiều loài gia súc. Miễn dịch tạo ra khi sử dụng vacxin bổ trợ hydroxid nhôm giảm nhanh chóng sau 4 Ờ 6 tháng. Một vacxin nhũựầu kép có thể bảo hộ gia súc tới gần 1 năm.
động vật ựược tiêm vacxin nếu không ựược bảo hộ hoàn toàn thì sẽ trở thành nguồn gây bệnh. Virus có thể nhân lên, ựược khuếch tán nhưng gia súc lại không biểu hiện bất cứ triệu chứng nào của căn bệnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 43
PHẦN III. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Khảo sát tình hình chăn nuôi gia súc tại một số tỉnh miền Bắc trong những năm gần ựây. 3.1.2. Khảo sát tình hình dịch bệnh LMLM ở Việt Nam từ năm 2005 ựến tháng 6/2009.
. 3.1.3. Kết quả chẩn ựoán, ựịnh typ virut LMLM.
3.1.4. đánh giá hiệu quả của công tác tiêm phòng vacxin LMLM. 3.1.5. Xác ựịnh trình tự gen của virus LMLM trong những năm gần ựây. 3.1.6. Một sốựặc ựiểm dịch tễ học bệnh LMLM ở trâu, bò và lợn trên ựịa bàn Thái Bình từ năm 2005 ựến năm 2009.
3.1.7. đề xuất các giải pháp phòng chống bệnh LMLM.
3.2. NGUYÊN LIỆU
3.2.1. Bệnh phẩm
Biểu mô, huyết thanh trâu bò, lợn cần chuẩn ựoán nuôi ở các ựịa phương của một số tỉnh miền Bắc, Việt Nam.
3.2.2. Hóa chất
Hoá chất thông thường trong phòng thắ nghiệm: Nước cất/nước khử ion vô trùng tuyệt ựối, NaOH 0,1M; HCL 0,1M; red phenol 1%; axit xitric; dung dịch H2SO4.
3.2.3. Bộ CHEKIT FMD Ờ 3ABC Ờ BO Ờ OV và bộ CHEKIT FMD Ờ 3ABC Ờ PO của Bommeli Diagnostics (Thuỵ Sĩ) ựể phát hiện kháng thể 3ABC Ờ PO của Bommeli Diagnostics (Thuỵ Sĩ) ựể phát hiện kháng thể
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 44
kháng virus LMLM ở trâu bò và lợn do nhiễm tự nhiên bao gồm:
- đĩa ELISA 96 giếng ựã ựược gắn kháng nguyên 3ABC kháng virus LMLM. - Huyết thanh chuẩn làm ựối chứng âm, dương.
- Dung dịch pha loãng mẫu (sample - diluent). - Dung dịch nước rửa (concentrate)
- Conjugate.
- Dung dịch substrate Ờ TMB
- Dung dịch dừng phản ứng (stopping solution).
3.2.4. Bộ KIT LPB Ờ ELISA của Pirbright (Anh) ựể phát hiện kháng thể LMLM trong huyết thanh trâu bò ựã tiêm phòng vacxin, bao gồm:
+Sinh phẩm:
- Kháng thể thỏ kháng virus LMLM serotype O và Asia1. - Kháng nguyên virus LMLM chuẩn type O và Asia1.
- Huyết thanh chuẩn serotype O và Asia1 làm ựối chứng dương mạnh (C++), ựối chứng dương yếu (C+), ựối chứng âm (C-).
- Guinea pig serotype O và Asia1. - Conjugate.
+ Hoá chất:
- Viên Coatinh buffer (Bicabonat natri), viên PBS (Phosphate bufferedsaline)
- Dung dịch Tween 20; Sữa tách bơ, Substrate Ờ TMB.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học phân tắch 3.3.2. định lượng các chỉ tiêu dịch tễ 3.3.2. định lượng các chỉ tiêu dịch tễ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 45
3.3.2.1. Hệ số năm dịch (HSND): ựược tắnh theo công thức Chỉ số mắc bệnh trung bình tháng/năm Chỉ số mắc bệnh trung bình tháng/năm HSND = Chỉ số mắc bệnh trung bình tháng/số năm nghiêncứu Số mắc bệnh trong năm ựó CSMBTBT/N = 12 tháng Số mắc bệnh trong số năm ngiên cứu CSMBTBT/SNNC = Số tháng trong số năm nghiên cứu Năm nào có hệ số năm dịch >1 là năm dịch.
3.3.2.2. Tỷ lệ hiện mắc (TLHM): ựược tắnh theo công thức
Số gia súc hiện mắc trong một giai ựoạn xác ựịnh TLHM =
Tổng ựàn gia súc bình quân trong giai ựoạn ựó x 100
3.3.2.3. Tỷ lệ mới mắc (TLMM ): ựược tắnh theo công thức Số mới mắc trong một thời kỳ
TLMM =
Tổng ựàn có nguy cơ trong thời kỳựó x 100
3.3.2.4. Tốc ựộ mới mắc (TDMM ): ựược tắnh theo công thức Tỷ lệ mới mắc trong thời kỳ nghiên cứu TDMM =
đơn vị thời gian nghiên cứu ( ngày, tuần, tháng, quý, năm )
3.3.2.5. Tỷ lệ tử vong (TLTV): ựược tắnh theo công thức
Số chết vì một bệnh của quần thể trong một thời gian TLTV =
Tổng số mắc bệnh của quần thể trong thời gian ựó
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 46
3.3.2.6. Nguy cơ tương ựối (RR)
Nguy cơ tương ựối là nguy cơ mắc bệnh của các cá thể có tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ so với các cá thể không tiếp xúc với yếu tố nguy cơ.
Kết quả xét nghiệm Dương tắnh Âm tắnh Cộng Vùng có dịch a b a+b Vùng chưa có dịch c d c+d Cộng a+c b+d Trong ựó:
a là số gia súc xét nghiệm dương tắnh ở trong vùng dịch b là số gia súc xét nghiệm âm tắnh ở trong vùng dịch c là số gia súc xét nghiệm dương tắnh ở vùng chưa có dịch d là số gia súc xét nghiệm âm tắnh ở vùng chưa có dịch
a/(a+b) RR =
c/(c+d)
3.3.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản
- Phương pháp lấy máu: Máu ựược lấy từ tĩnh mạch cổ ựối với trâu bò, và vịnh tĩnh mạch cổựối với lợn, bằng bơm kim tiêm vô trùng, lượng tối thiểu là 3ml ựựng trong ống falcol, chắt huyết thanh vào các ống eppendorf 1,5ml, bổ xung chất chống thối và chống nấm.
- Phương pháp lấy mẫu biểu mô: Mẫu bệnh phẩm thắch hợp nhất ựể chẩn ựoán virus LMLM là biểu mô mụn nước sắp vỡ hay mới vỡ ở miệng, lưỡi, chân và dịch mụn nước. Tốt nhất lấy bệnh phẩm những con ựang sốt, ựang có mụn loét. Dùng kéo nhọn, panh vô trùng lấy biểu mô bị loét khoảng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 47
3-5 gam (diện tắch khoảng 2cm2), yêu cầu mỗi lần lấy 4-5 con. Nếu mụn nước sắp vỡ, lấy syringe hút nước trong mụn và lấy biểu mô.
Mẫu bệnh phẩm cho vào lọ thuỷ tinh chịu ựược nhiệt ựộ sâu, trong ựó có dung dịch bảo quản PBS 0,04 M, có kháng sinh và một lượng glycerine tương ựương, vặn chặt nút, gắn xi, ghi nhãn các chỉ tiêu.
- Bảo quản và vận chuyển mẫu: Huyết thanh ựược bảo quản ở 40C, bảo quản trong phắch lạnh vận chuyển ựến phòng thắ nghiệm càng sớm càng tốt. Hoặc mẫu ựược bảo quản ở nhiệt ựộ âm của tủ lạnh nếu chưa chuyển kịp về phòng thắ nghiệm hoặc ở Ờ 200C ựến Ờ 800C tại phòng thắ nghiệm khi chưa dùng
3.3.4. Phương pháp 3ABC Ờ ELISA
a. Cơ sở khoa học
Khi virus LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc móng guốc chẵn, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra. Trong quá trình này, virus vừa tạo ra các thành phần ựể tái tạo các hạt virus mới (các virion), vừa tạo ra các thành phần không tham gia tạo thành các hạt virion mới mà chỉ ựóng vai trò các men giúp cho quá trình nhân bản. Các thành phần kết hợp thành bản thân virus có tắnh kháng nguyên gọi là protein cấu trúc (structure protein). Các thành phần không tham gia kết hợp thành virion mới và có tắnh kháng nguyên gọi là protein không cấu trúc (non-structure protein).
Trong các protein không cấu trúc của virus LMLM thì kháng nguyên 3ABC có tắnh kháng nguyên rất cao, nó kắch thắch cơ thể gia súc tạo ra kháng thể ựặc hiệu với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bò bị nhiễm. Do ựó việc phát hiện kháng thể ựặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc ựang bị nhiễm virus LMLM.
Hiện nay nước ta ựang sử dụng vacxin LMLM nhập từ hãng Intervet (Hà Lan) và Merial (Pháp). Những loại vacxin này là vô hoạt và ựã loại bỏ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 48
những kháng nguyên không cấu trúc. Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kắch thắch cơ thể sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt virus) chứ không có kháng thể kháng lại kháng nguyên không cấu trúc 3ABC. Do ựó, dùng phản ứng ELISA sẽ phát hiện ựược trâu bò nhiễm virus LMLM, kể cả những trâu bò ựã ựược tiêm phòng.
b. Sơ ựồ ựĩa phản ứng CHEKIT FMD Ờ 3ABC Ờ BO Ờ OV dùng cho huyết thanh trâu bò.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N N 13 B P P 14 C 1 7 15 D 2 8 E 3 9 F 4 10 G 5 11 H 6 12 Chú thắch:
N: huyết thanh ựố chứng âm P: Huyết thanh ựối chứng dương 1, 2, ..., 92: huyết thanh cần kiểm tra
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 49
c. Các bước tiến hành: Bước 1: Gắn mẫu vào ựĩa
- Pha loãng mẫu huyết thanh cần kiểm tra và huyết thanh ựối chứng với dung dịch pha loãng mẫu ựã chuẩn bị (sample Ờ diluent) theo tỉ lệ 1:100.
- Nhỏ vào mỗi giếng 100ộl huyết thanh cần kiểm tra và huyết thanh ựối chứng (âm, dương) ựã pha loãng theo sơ ựồựĩa phản ứng.
- đậy nắp, cho ựĩa vào trong hộp ẩm và ựặt vào tủ ấm, ủ ựĩa ở 370C trong 1 giờ.
- Phức hợp kháng nguyên 3ABC Ờ Kháng thể 3ABC sẽ ựược tạo thành nếu trong huyết thanh kiểm tra có kháng thể 3ABC.
Bước 2: Rửa ựĩa ELISA
Sau 1 giờủ, lấy ựĩa ra và tiến hành rửa ựĩa 3 lần bằng máy rửa ựể loại bỏ hết phần kháng thể 3ABC thừa. Mỗi lần rửa cần nhỏ ắt nhất vào mỗi giếng 300 ộl dung dịch nước rửa ựã pha loãng, tránh tạo các bọt khắ trong quá trình rửa. Sau khi rửa, ựập nhẹ ựĩa lên giấy thấm ựể các giếng khô hết. Không ựể các giếng ựã khô trong một thời gian dài trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
Bước 3: Gắn Conjugate
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa, mỗi giếng 100ộl Conjugate.
- đậy nắp, cho ựĩa vào trong hộp ẩm và ựặt vào tủ ấm, ủ ựĩa ở 370C trong 1 giờ.
- Sau 1 giờ lấy ựĩa ra và tiến hành rửa ựĩa như bước 2 ựể loại bỏ hết Conjugate thừa
Bước 4: Gắn Substrate TMB
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 50
Trước khi tiến hành bước 4, Substrate TMB ựược làm ấm ở 250C. Sau ựó nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa, mỗi giếng 100ộl Substrate TMB.
- để ựĩa ở nhiệt ựộ phòng trong 15 Ờ 20 phút.
Bước 5: Dừng phản ứng
Trước khi tiến hành bước 5, dung dịch dừng phản ứng (stopping solution) ở nhiệt ựộ bảo quản 1 Ờ 80C ựược làm ấm ở 18 Ờ 250C. Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa, mỗi giếng 100ộl dung dịch dừng phản ứng.
Bước 6: đọc kết quả phản ứng
đọc kết quả phản ứng trên máy ựọc ELISA Titertek Multiskan Plus MKII, kắnh lọc 450nm. Kết quả phản ứng ựược phân tắch dựa trên sự so sánh giá trị OD của huyết thanh ựối chứng và OD của huyết thanh kiểm tra theo công thức sau:
ODM - ODN
Value (% ) = X 100% ODP - ODN
ODM: giá trị OD của mẫu huyết thanh kiểm tra. ODN : giá trị OD của mẫu huyết thanh ựối chứng âm. ODP : giá trị OD của huyết thanh ựối chứng dương.
Giá trị (%) < 20% 20% - 30% > 30% Kết quả Âm tắnh Nghi ngờ Dương tắnh
Khi kết quả xét nghiệm là dương tắnh, chúng ta kết luận trong huyết thanh của trâu bò kiểm tra có kháng thể kháng virus LMLM do nhiễm virus tự nhiên. Như vậy, kết luận trâu bò kiểm tra ựã bị nhiễm virus LMLM. Với
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 51
những mẫu nghi ngờ cần lấy máu xét nghiệm lại sau 15 ngày.
d. Sơ ựồ ựĩa phản ứng CHEKIT FMD Ờ 3ABC Ờ BO Ờ PO dùng cho huyết thanh lợn.
Tương tự như sơ ựồ phản ứng cuả CHEKIT FMD Ờ 3ABC Ờ BO Ờ OV chỉ khác ở ựộ pha loãng mẫu huyết thanh của lợn là 1:10. Và ựọc kết quả ở bước sóng 405nm. Còn các bước tiến hành phản ứng thì tương tự.
3.3.5. Phương pháp Liquid Phase Blocking ELISA (LPB Ờ ELISA)
a. Mục ựắch
Xác ựịnh sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh trâu bò sau tiêm phòng vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá typ O- Asia1.
b. Sơựồ ựĩa phản ứng LPB Ờ ELISA:
Mỗi serotype virus LMLM sẽ ựược kiểm tra trên từng ựĩa phản ứng riêng. Phản ứng ựược tiến hành theo sơựồựĩa phản ứng sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 B C++ C++ 2 2 C C+ C+ 3 3 D C+ C+ 4 4 E C- C- 5 5 F C- C- 6 6 G Ca Ca 7 7 H Ca Ca 8 8 40 40
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 52
Chú thắch:
C++ : Huyết thanh ựối chứng dương mạnh C+ : Huyết thanh ựối chứng dương yếu C- : Huyết thanh ựối chứng âm
Ca : đối chứng kháng nguyên
1,2,... 40 : Huyết thanh trâu, bò cần kiểm tra
c. Các bước tiến hành Bước 1: Coat ựĩa (phủựĩa)
- Chuẩn bị kháng thể thỏ kháng virus LMLM tương ứng với các sertype O và Asia1. Pha loãng mỗi loại kháng thể thỏ tương ứng với từng serotype O và Asia1 trong dung dịch Coating buffer theo tỷ lệ 1:500. Tắnh lượng dung dịch pha loãng ựủ dùng cho số ựĩa ELISA sử dụng cho phản ứng. Nghĩa là mỗi ựĩa ELISA cần Coat 5ml kháng thể thỏ pha loãng thì khi pha cần dư thêm 1ml.
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa ELISA, mỗi giếng 50ộl kháng thể thỏ pha loãng.
- đậy nắp, ủ và lắc ựĩa trong tủấm 370C/1 giờ hoặc ủ qua ựêm ở 40C.
Bước 2: Thực hiện phản ứng trung hoà trên ựĩa nhựa polyropylen 96 giếng ựáy chữ U
- Các loại huyết thanh ựối chứng (C++, C+, C-) và huyết thanh cần kiểm tra ựược pha loãng theo tỷ lệ 1:16 với Buffer A.
- Kháng nguyên virus LMLM chuẩn type O và Asia1 ựược pha loãng trong Buffer A theo tỷ lệ 1: 100.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 53
+ Ở cột 1 Ờ 2: nhỏ vào mỗi giếng 30ộl huyết thanh ựối chứng C++, C+, C- ựã pha loãng và 30ộl dung dịch Buffer A ở các vị trắ tương ứng theo sơ ựồựĩa phản ứng (4giếng/loại).
+ Từ cột 3 Ờ 12: Nhỏ vào mỗi giếng 30ộl huyết thanh cần kiểm tra ựã pha loãng theo sơ ựồựĩa phản ứng (2 giếng/loại).
+ Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa nhựa polypropylen, mỗi giếng 30ộl kháng nguyên virus LMLM chuẩn type O Ờ Asia1 pha loãng.
+ Tiếp theo ủ hỗn hợp kháng nguyên Ờ huyết thanh trong ựĩa nhựa polypropylen qua ựêm ở 40C.
Bước 3: Gắn mẫu vào ựĩa ELISA ựã Coat
- Rửa ựĩa ELISA ựã Coat 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M. - Chuyển 50ộl hỗn hợp kháng nguyên Ờ huyết thanh ựã ủ từ ựĩa nhựa chữ U sang ựĩa ELISA theo vị trắ tương ứng như sơ ựồ ựĩa phản ứng. đậy nắp, ủ và lắc ựĩa trong tủấm ở nhiệt ựộ 370C/1 giờ.