Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 45
3.3.2.1. Hệ số năm dịch (HSND): ựược tắnh theo công thức Chỉ số mắc bệnh trung bình tháng/năm Chỉ số mắc bệnh trung bình tháng/năm HSND = Chỉ số mắc bệnh trung bình tháng/số năm nghiêncứu Số mắc bệnh trong năm ựó CSMBTBT/N = 12 tháng Số mắc bệnh trong số năm ngiên cứu CSMBTBT/SNNC = Số tháng trong số năm nghiên cứu Năm nào có hệ số năm dịch >1 là năm dịch.
3.3.2.2. Tỷ lệ hiện mắc (TLHM): ựược tắnh theo công thức
Số gia súc hiện mắc trong một giai ựoạn xác ựịnh TLHM =
Tổng ựàn gia súc bình quân trong giai ựoạn ựó x 100
3.3.2.3. Tỷ lệ mới mắc (TLMM ): ựược tắnh theo công thức Số mới mắc trong một thời kỳ
TLMM =
Tổng ựàn có nguy cơ trong thời kỳựó x 100
3.3.2.4. Tốc ựộ mới mắc (TDMM ): ựược tắnh theo công thức Tỷ lệ mới mắc trong thời kỳ nghiên cứu TDMM =
đơn vị thời gian nghiên cứu ( ngày, tuần, tháng, quý, năm )
3.3.2.5. Tỷ lệ tử vong (TLTV): ựược tắnh theo công thức
Số chết vì một bệnh của quần thể trong một thời gian TLTV =
Tổng số mắc bệnh của quần thể trong thời gian ựó
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 46
3.3.2.6. Nguy cơ tương ựối (RR)
Nguy cơ tương ựối là nguy cơ mắc bệnh của các cá thể có tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ so với các cá thể không tiếp xúc với yếu tố nguy cơ.
Kết quả xét nghiệm Dương tắnh Âm tắnh Cộng Vùng có dịch a b a+b Vùng chưa có dịch c d c+d Cộng a+c b+d Trong ựó:
a là số gia súc xét nghiệm dương tắnh ở trong vùng dịch b là số gia súc xét nghiệm âm tắnh ở trong vùng dịch c là số gia súc xét nghiệm dương tắnh ở vùng chưa có dịch d là số gia súc xét nghiệm âm tắnh ở vùng chưa có dịch
a/(a+b) RR =
c/(c+d)
3.3.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản
- Phương pháp lấy máu: Máu ựược lấy từ tĩnh mạch cổ ựối với trâu bò, và vịnh tĩnh mạch cổựối với lợn, bằng bơm kim tiêm vô trùng, lượng tối thiểu là 3ml ựựng trong ống falcol, chắt huyết thanh vào các ống eppendorf 1,5ml, bổ xung chất chống thối và chống nấm.
- Phương pháp lấy mẫu biểu mô: Mẫu bệnh phẩm thắch hợp nhất ựể chẩn ựoán virus LMLM là biểu mô mụn nước sắp vỡ hay mới vỡ ở miệng, lưỡi, chân và dịch mụn nước. Tốt nhất lấy bệnh phẩm những con ựang sốt, ựang có mụn loét. Dùng kéo nhọn, panh vô trùng lấy biểu mô bị loét khoảng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 47
3-5 gam (diện tắch khoảng 2cm2), yêu cầu mỗi lần lấy 4-5 con. Nếu mụn nước sắp vỡ, lấy syringe hút nước trong mụn và lấy biểu mô.
Mẫu bệnh phẩm cho vào lọ thuỷ tinh chịu ựược nhiệt ựộ sâu, trong ựó có dung dịch bảo quản PBS 0,04 M, có kháng sinh và một lượng glycerine tương ựương, vặn chặt nút, gắn xi, ghi nhãn các chỉ tiêu.
- Bảo quản và vận chuyển mẫu: Huyết thanh ựược bảo quản ở 40C, bảo quản trong phắch lạnh vận chuyển ựến phòng thắ nghiệm càng sớm càng tốt. Hoặc mẫu ựược bảo quản ở nhiệt ựộ âm của tủ lạnh nếu chưa chuyển kịp về phòng thắ nghiệm hoặc ở Ờ 200C ựến Ờ 800C tại phòng thắ nghiệm khi chưa dùng
3.3.4. Phương pháp 3ABC Ờ ELISA
a. Cơ sở khoa học
Khi virus LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc móng guốc chẵn, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra. Trong quá trình này, virus vừa tạo ra các thành phần ựể tái tạo các hạt virus mới (các virion), vừa tạo ra các thành phần không tham gia tạo thành các hạt virion mới mà chỉ ựóng vai trò các men giúp cho quá trình nhân bản. Các thành phần kết hợp thành bản thân virus có tắnh kháng nguyên gọi là protein cấu trúc (structure protein). Các thành phần không tham gia kết hợp thành virion mới và có tắnh kháng nguyên gọi là protein không cấu trúc (non-structure protein).
Trong các protein không cấu trúc của virus LMLM thì kháng nguyên 3ABC có tắnh kháng nguyên rất cao, nó kắch thắch cơ thể gia súc tạo ra kháng thể ựặc hiệu với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bò bị nhiễm. Do ựó việc phát hiện kháng thể ựặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc ựang bị nhiễm virus LMLM.
Hiện nay nước ta ựang sử dụng vacxin LMLM nhập từ hãng Intervet (Hà Lan) và Merial (Pháp). Những loại vacxin này là vô hoạt và ựã loại bỏ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 48
những kháng nguyên không cấu trúc. Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kắch thắch cơ thể sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt virus) chứ không có kháng thể kháng lại kháng nguyên không cấu trúc 3ABC. Do ựó, dùng phản ứng ELISA sẽ phát hiện ựược trâu bò nhiễm virus LMLM, kể cả những trâu bò ựã ựược tiêm phòng.
b. Sơ ựồ ựĩa phản ứng CHEKIT FMD Ờ 3ABC Ờ BO Ờ OV dùng cho huyết thanh trâu bò.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N N 13 B P P 14 C 1 7 15 D 2 8 E 3 9 F 4 10 G 5 11 H 6 12 Chú thắch:
N: huyết thanh ựố chứng âm P: Huyết thanh ựối chứng dương 1, 2, ..., 92: huyết thanh cần kiểm tra
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 49
c. Các bước tiến hành: Bước 1: Gắn mẫu vào ựĩa
- Pha loãng mẫu huyết thanh cần kiểm tra và huyết thanh ựối chứng với dung dịch pha loãng mẫu ựã chuẩn bị (sample Ờ diluent) theo tỉ lệ 1:100.
- Nhỏ vào mỗi giếng 100ộl huyết thanh cần kiểm tra và huyết thanh ựối chứng (âm, dương) ựã pha loãng theo sơ ựồựĩa phản ứng.
- đậy nắp, cho ựĩa vào trong hộp ẩm và ựặt vào tủ ấm, ủ ựĩa ở 370C trong 1 giờ.
- Phức hợp kháng nguyên 3ABC Ờ Kháng thể 3ABC sẽ ựược tạo thành nếu trong huyết thanh kiểm tra có kháng thể 3ABC.
Bước 2: Rửa ựĩa ELISA
Sau 1 giờủ, lấy ựĩa ra và tiến hành rửa ựĩa 3 lần bằng máy rửa ựể loại bỏ hết phần kháng thể 3ABC thừa. Mỗi lần rửa cần nhỏ ắt nhất vào mỗi giếng 300 ộl dung dịch nước rửa ựã pha loãng, tránh tạo các bọt khắ trong quá trình rửa. Sau khi rửa, ựập nhẹ ựĩa lên giấy thấm ựể các giếng khô hết. Không ựể các giếng ựã khô trong một thời gian dài trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
Bước 3: Gắn Conjugate
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa, mỗi giếng 100ộl Conjugate.
- đậy nắp, cho ựĩa vào trong hộp ẩm và ựặt vào tủ ấm, ủ ựĩa ở 370C trong 1 giờ.
- Sau 1 giờ lấy ựĩa ra và tiến hành rửa ựĩa như bước 2 ựể loại bỏ hết Conjugate thừa
Bước 4: Gắn Substrate TMB
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 50
Trước khi tiến hành bước 4, Substrate TMB ựược làm ấm ở 250C. Sau ựó nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa, mỗi giếng 100ộl Substrate TMB.
- để ựĩa ở nhiệt ựộ phòng trong 15 Ờ 20 phút.
Bước 5: Dừng phản ứng
Trước khi tiến hành bước 5, dung dịch dừng phản ứng (stopping solution) ở nhiệt ựộ bảo quản 1 Ờ 80C ựược làm ấm ở 18 Ờ 250C. Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa, mỗi giếng 100ộl dung dịch dừng phản ứng.
Bước 6: đọc kết quả phản ứng
đọc kết quả phản ứng trên máy ựọc ELISA Titertek Multiskan Plus MKII, kắnh lọc 450nm. Kết quả phản ứng ựược phân tắch dựa trên sự so sánh giá trị OD của huyết thanh ựối chứng và OD của huyết thanh kiểm tra theo công thức sau:
ODM - ODN
Value (% ) = X 100% ODP - ODN
ODM: giá trị OD của mẫu huyết thanh kiểm tra. ODN : giá trị OD của mẫu huyết thanh ựối chứng âm. ODP : giá trị OD của huyết thanh ựối chứng dương.
Giá trị (%) < 20% 20% - 30% > 30% Kết quả Âm tắnh Nghi ngờ Dương tắnh
Khi kết quả xét nghiệm là dương tắnh, chúng ta kết luận trong huyết thanh của trâu bò kiểm tra có kháng thể kháng virus LMLM do nhiễm virus tự nhiên. Như vậy, kết luận trâu bò kiểm tra ựã bị nhiễm virus LMLM. Với
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 51
những mẫu nghi ngờ cần lấy máu xét nghiệm lại sau 15 ngày.
d. Sơ ựồ ựĩa phản ứng CHEKIT FMD Ờ 3ABC Ờ BO Ờ PO dùng cho huyết thanh lợn.
Tương tự như sơ ựồ phản ứng cuả CHEKIT FMD Ờ 3ABC Ờ BO Ờ OV chỉ khác ở ựộ pha loãng mẫu huyết thanh của lợn là 1:10. Và ựọc kết quả ở bước sóng 405nm. Còn các bước tiến hành phản ứng thì tương tự.
3.3.5. Phương pháp Liquid Phase Blocking ELISA (LPB Ờ ELISA)
a. Mục ựắch
Xác ựịnh sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh trâu bò sau tiêm phòng vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá typ O- Asia1.
b. Sơựồ ựĩa phản ứng LPB Ờ ELISA:
Mỗi serotype virus LMLM sẽ ựược kiểm tra trên từng ựĩa phản ứng riêng. Phản ứng ựược tiến hành theo sơựồựĩa phản ứng sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 B C++ C++ 2 2 C C+ C+ 3 3 D C+ C+ 4 4 E C- C- 5 5 F C- C- 6 6 G Ca Ca 7 7 H Ca Ca 8 8 40 40
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 52
Chú thắch:
C++ : Huyết thanh ựối chứng dương mạnh C+ : Huyết thanh ựối chứng dương yếu C- : Huyết thanh ựối chứng âm
Ca : đối chứng kháng nguyên
1,2,... 40 : Huyết thanh trâu, bò cần kiểm tra
c. Các bước tiến hành Bước 1: Coat ựĩa (phủựĩa)
- Chuẩn bị kháng thể thỏ kháng virus LMLM tương ứng với các sertype O và Asia1. Pha loãng mỗi loại kháng thể thỏ tương ứng với từng serotype O và Asia1 trong dung dịch Coating buffer theo tỷ lệ 1:500. Tắnh lượng dung dịch pha loãng ựủ dùng cho số ựĩa ELISA sử dụng cho phản ứng. Nghĩa là mỗi ựĩa ELISA cần Coat 5ml kháng thể thỏ pha loãng thì khi pha cần dư thêm 1ml.
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa ELISA, mỗi giếng 50ộl kháng thể thỏ pha loãng.
- đậy nắp, ủ và lắc ựĩa trong tủấm 370C/1 giờ hoặc ủ qua ựêm ở 40C.
Bước 2: Thực hiện phản ứng trung hoà trên ựĩa nhựa polyropylen 96 giếng ựáy chữ U
- Các loại huyết thanh ựối chứng (C++, C+, C-) và huyết thanh cần kiểm tra ựược pha loãng theo tỷ lệ 1:16 với Buffer A.
- Kháng nguyên virus LMLM chuẩn type O và Asia1 ựược pha loãng trong Buffer A theo tỷ lệ 1: 100.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 53
+ Ở cột 1 Ờ 2: nhỏ vào mỗi giếng 30ộl huyết thanh ựối chứng C++, C+, C- ựã pha loãng và 30ộl dung dịch Buffer A ở các vị trắ tương ứng theo sơ ựồựĩa phản ứng (4giếng/loại).
+ Từ cột 3 Ờ 12: Nhỏ vào mỗi giếng 30ộl huyết thanh cần kiểm tra ựã pha loãng theo sơ ựồựĩa phản ứng (2 giếng/loại).
+ Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa nhựa polypropylen, mỗi giếng 30ộl kháng nguyên virus LMLM chuẩn type O Ờ Asia1 pha loãng.
+ Tiếp theo ủ hỗn hợp kháng nguyên Ờ huyết thanh trong ựĩa nhựa polypropylen qua ựêm ở 40C.
Bước 3: Gắn mẫu vào ựĩa ELISA ựã Coat
- Rửa ựĩa ELISA ựã Coat 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M. - Chuyển 50ộl hỗn hợp kháng nguyên Ờ huyết thanh ựã ủ từ ựĩa nhựa chữ U sang ựĩa ELISA theo vị trắ tương ứng như sơ ựồ ựĩa phản ứng. đậy nắp, ủ và lắc ựĩa trong tủấm ở nhiệt ựộ 370C/1 giờ.
- Sau 1 giờ lấy ựĩa ra và rửa ựĩa 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M.
Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện Guinea pig
- Kháng thể phát hiện Guinea pig tương ứng với các Serotype O và Asia1 ựược pha loãng theo tỷ lệ 1:100 với Buffer B.
- Nhỏ vào các giếng của ựĩa ELISA, mỗi giếng 50ộl Guinea pig ựã pha loãng. đậy nắp, ủ và lắc ựĩa trong tủấm ở nhiệt ựộ 370C/1giờ.
- Sau 1 giờ lấy ựĩa ra và rửa ựĩa 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M
Bước 5: Gắn Conjugate
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 54
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa ELISA, mỗi giếng 50ộl Guinea pig ựã pha loãng. đậy nắp, ủ và lắc ựĩa trong tủấm ở nhệt ựộ 370C/40 phút.
- Sau 40 phút lấy ựĩa ra và rửa ựĩa 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M.
Bước 6: Gắn Substrate TMB
- Pha loãng TMB theo công thức: 9ml nước cất + 1 ml axit cetrixaxetat + 100 ộl TMB + 1,3ộl H202 30%.
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa ELISA, mỗi giếng 50ộl Substrate TMB ựã pha loãng.
- để ựĩa ELISA ở nhiệt ựộ phòng 15 Ờ 20 phút.
Bước 7: Dừng phản ứng
Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa ELISA, mỗi giếng 50ộl dung dịch H2SO4 1,25M ựể dừng phản ứng.
Bước 8: đọc kết quả phản ứng.
- đọc kết quả phản ứng trên máy ựọc ELISA Titertek Multiskan Plus MKII, kắnh lọc 492nm. Sử dụng phần mềm EDI ựể tắnh PI (Percentage Inhibition).
- Công thức tắnh PI :
OD huyết thanh
PI = 100 Ờ x 100 OD trung bình Ca
+ Nếu PI ≥ 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra ựược coi là dương tắnh, kết luận trong kiểm tra có kháng thể LMLM.
+ Nếu PI < 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra ựược coi là âm tắnh, kết luận trong huyết thanh kiểm tra không có kháng thể LMLM
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 55
3.4. Xử lý số liệu
Tất cả số liệu về kết quả nghiên cứu ựược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh vật học. Số mẫu dương tắnh * Tỷ lệ nhiễm virus LMLM (%) = Số mẫu xét nghiệm X100 Số mẫu có kháng thể * Tỷ lệ mẫu có kháng thể (%) = Số mẫu xét nghiệm X100 * Tỷ lệ bảo hộ(%) = Số mẫu bảo hộ X 100
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 56
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tình hình chăn nuôi gia súc tại một số tỉnh miền Bắc trong những năm gần ựây.
4.1.1. Tình hình chăn nuôi gia súc tại Hà Nội
Hà Nội nằm ở trung tâm ựồng bằng sông Hồng, phắa Bắc giáp với tỉnh Thái Nguyên, phắa Tây và Nam giáp với tỉnh Hà Tây cũ (nay thuộc Hà Nội), phắa đông và đông Nam giáp với tỉnh Bắc Ninh và Hưng Yên. Hà Nội nằm trong vùng khắ hậu nhiệt ựới có gió mùa, thời tiết có ựủ 4 mùa: xuân, hạ, thu