Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 44
kháng virus LMLM ở trâu bị và lợn do nhiễm tự nhiên bao gồm:
- ðĩa ELISA 96 giếng đã được gắn kháng nguyên 3ABC kháng virus LMLM. - Huyết thanh chuẩn làm đối chứng âm, dương.
- Dung dịch pha lỗng mẫu (sample - diluent). - Dung dịch nước rửa (concentrate)
- Conjugate.
- Dung dịch substrate – TMB
- Dung dịch dừng phản ứng (stopping solution).
3.2.4. Bộ KIT LPB – ELISA của Pirbright (Anh) để phát hiện kháng thể LMLM trong huyết thanh trâu bị đã tiêm phịng vacxin, bao gồm:
+Sinh phẩm:
- Kháng thể thỏ kháng virus LMLM serotype O và Asia1. - Kháng nguyên virus LMLM chuẩn type O và Asia1.
- Huyết thanh chuẩn serotype O và Asia1 làm đối chứng dương mạnh (C++), đối chứng dương yếu (C+), đối chứng âm (C-).
- Guinea pig serotype O và Asia1. - Conjugate.
+ Hố chất:
- Viên Coatinh buffer (Bicabonat natri), viên PBS (Phosphate bufferedsaline)
- Dung dịch Tween 20; Sữa tách bơ, Substrate – TMB.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp dịch tễ học mơ tả, dịch tễ học phân tích 3.3.2. ðịnh lượng các chỉ tiêu dịch tễ 3.3.2. ðịnh lượng các chỉ tiêu dịch tễ
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 45
3.3.2.1. Hệ số năm dịch (HSND): được tính theo cơng thức Chỉ số mắc bệnh trung bình tháng/năm Chỉ số mắc bệnh trung bình tháng/năm HSND = Chỉ số mắc bệnh trung bình tháng/số năm nghiêncứu Số mắc bệnh trong năm đĩ CSMBTBT/N = 12 tháng Số mắc bệnh trong số năm ngiên cứu CSMBTBT/SNNC = Số tháng trong số năm nghiên cứu Năm nào cĩ hệ số năm dịch >1 là năm dịch.
3.3.2.2. Tỷ lệ hiện mắc (TLHM): được tính theo cơng thức
Số gia súc hiện mắc trong một giai đoạn xác định TLHM =
Tổng đàn gia súc bình quân trong giai đoạn đĩ x 100
3.3.2.3. Tỷ lệ mới mắc (TLMM ): được tính theo cơng thức Số mới mắc trong một thời kỳ
TLMM =
Tổng đàn cĩ nguy cơ trong thời kỳđĩ x 100
3.3.2.4. Tốc độ mới mắc (TDMM ): được tính theo cơng thức Tỷ lệ mới mắc trong thời kỳ nghiên cứu TDMM =
ðơn vị thời gian nghiên cứu ( ngày, tuần, tháng, quý, năm )
3.3.2.5. Tỷ lệ tử vong (TLTV): được tính theo cơng thức
Số chết vì một bệnh của quần thể trong một thời gian TLTV =
Tổng số mắc bệnh của quần thể trong thời gian đĩ
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 46 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2.6. Nguy cơ tương đối (RR)
Nguy cơ tương đối là nguy cơ mắc bệnh của các cá thể cĩ tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ so với các cá thể khơng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ.
Kết quả xét nghiệm Dương tính Âm tính Cộng Vùng cĩ dịch a b a+b Vùng chưa cĩ dịch c d c+d Cộng a+c b+d Trong đĩ:
a là số gia súc xét nghiệm dương tính ở trong vùng dịch b là số gia súc xét nghiệm âm tính ở trong vùng dịch c là số gia súc xét nghiệm dương tính ở vùng chưa cĩ dịch d là số gia súc xét nghiệm âm tính ở vùng chưa cĩ dịch
a/(a+b) RR =
c/(c+d)
3.3.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản
- Phương pháp lấy máu: Máu được lấy từ tĩnh mạch cổ đối với trâu bị, và vịnh tĩnh mạch cổđối với lợn, bằng bơm kim tiêm vơ trùng, lượng tối thiểu là 3ml đựng trong ống falcol, chắt huyết thanh vào các ống eppendorf 1,5ml, bổ xung chất chống thối và chống nấm.
- Phương pháp lấy mẫu biểu mơ: Mẫu bệnh phẩm thích hợp nhất để chẩn đốn virus LMLM là biểu mơ mụn nước sắp vỡ hay mới vỡ ở miệng, lưỡi, chân và dịch mụn nước. Tốt nhất lấy bệnh phẩm những con đang sốt, đang cĩ mụn loét. Dùng kéo nhọn, panh vơ trùng lấy biểu mơ bị loét khoảng
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 47
3-5 gam (diện tích khoảng 2cm2), yêu cầu mỗi lần lấy 4-5 con. Nếu mụn nước sắp vỡ, lấy syringe hút nước trong mụn và lấy biểu mơ.
Mẫu bệnh phẩm cho vào lọ thuỷ tinh chịu được nhiệt độ sâu, trong đĩ cĩ dung dịch bảo quản PBS 0,04 M, cĩ kháng sinh và một lượng glycerine tương đương, vặn chặt nút, gắn xi, ghi nhãn các chỉ tiêu.
- Bảo quản và vận chuyển mẫu: Huyết thanh được bảo quản ở 40C, bảo quản trong phích lạnh vận chuyển đến phịng thí nghiệm càng sớm càng tốt. Hoặc mẫu được bảo quản ở nhiệt độ âm của tủ lạnh nếu chưa chuyển kịp về phịng thí nghiệm hoặc ở – 200C đến – 800C tại phịng thí nghiệm khi chưa dùng
3.3.4. Phương pháp 3ABC – ELISA
a. Cơ sở khoa học
Khi virus LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc mĩng guốc chẵn, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra. Trong quá trình này, virus vừa tạo ra các thành phần để tái tạo các hạt virus mới (các virion), vừa tạo ra các thành phần khơng tham gia tạo thành các hạt virion mới mà chỉ đĩng vai trị các men giúp cho quá trình nhân bản. Các thành phần kết hợp thành bản thân virus cĩ tính kháng nguyên gọi là protein cấu trúc (structure protein). Các thành phần khơng tham gia kết hợp thành virion mới và cĩ tính kháng nguyên gọi là protein khơng cấu trúc (non-structure protein).
Trong các protein khơng cấu trúc của virus LMLM thì kháng nguyên 3ABC cĩ tính kháng nguyên rất cao, nĩ kích thích cơ thể gia súc tạo ra kháng thể đặc hiệu với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bị bị nhiễm. Do đĩ việc phát hiện kháng thể đặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc đang bị nhiễm virus LMLM.
Hiện nay nước ta đang sử dụng vacxin LMLM nhập từ hãng Intervet (Hà Lan) và Merial (Pháp). Những loại vacxin này là vơ hoạt và đã loại bỏ
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 48
những kháng nguyên khơng cấu trúc. Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt virus) chứ khơng cĩ kháng thể kháng lại kháng nguyên khơng cấu trúc 3ABC. Do đĩ, dùng phản ứng ELISA sẽ phát hiện được trâu bị nhiễm virus LMLM, kể cả những trâu bị đã được tiêm phịng.
b. Sơ đồ đĩa phản ứng CHEKIT FMD – 3ABC – BO – OV dùng cho huyết thanh trâu bị.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N N 13 B P P 14 C 1 7 15 D 2 8 E 3 9 F 4 10 G 5 11 H 6 12 Chú thích:
N: huyết thanh đố chứng âm P: Huyết thanh đối chứng dương 1, 2, ..., 92: huyết thanh cần kiểm tra
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 49
c. Các bước tiến hành: Bước 1: Gắn mẫu vào đĩa
- Pha lỗng mẫu huyết thanh cần kiểm tra và huyết thanh đối chứng với dung dịch pha lỗng mẫu đã chuẩn bị (sample – diluent) theo tỉ lệ 1:100.
- Nhỏ vào mỗi giếng 100µl huyết thanh cần kiểm tra và huyết thanh đối chứng (âm, dương) đã pha lỗng theo sơ đồđĩa phản ứng.
- ðậy nắp, cho đĩa vào trong hộp ẩm và đặt vào tủ ấm, ủ đĩa ở 370C trong 1 giờ.
- Phức hợp kháng nguyên 3ABC – Kháng thể 3ABC sẽ được tạo thành nếu trong huyết thanh kiểm tra cĩ kháng thể 3ABC.
Bước 2: Rửa đĩa ELISA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau 1 giờủ, lấy đĩa ra và tiến hành rửa đĩa 3 lần bằng máy rửa để loại bỏ hết phần kháng thể 3ABC thừa. Mỗi lần rửa cần nhỏ ít nhất vào mỗi giếng 300 µl dung dịch nước rửa đã pha lỗng, tránh tạo các bọt khí trong quá trình rửa. Sau khi rửa, đập nhẹ đĩa lên giấy thấm để các giếng khơ hết. Khơng để các giếng đã khơ trong một thời gian dài trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
Bước 3: Gắn Conjugate
- Nhỏ vào tất cả các giếng của đĩa, mỗi giếng 100µl Conjugate.
- ðậy nắp, cho đĩa vào trong hộp ẩm và đặt vào tủ ấm, ủ đĩa ở 370C trong 1 giờ.
- Sau 1 giờ lấy đĩa ra và tiến hành rửa đĩa như bước 2 để loại bỏ hết Conjugate thừa
Bước 4: Gắn Substrate TMB
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 50
Trước khi tiến hành bước 4, Substrate TMB được làm ấm ở 250C. Sau đĩ nhỏ vào tất cả các giếng của đĩa, mỗi giếng 100µl Substrate TMB.
- ðể đĩa ở nhiệt độ phịng trong 15 – 20 phút.
Bước 5: Dừng phản ứng
Trước khi tiến hành bước 5, dung dịch dừng phản ứng (stopping solution) ở nhiệt độ bảo quản 1 – 80C được làm ấm ở 18 – 250C. Nhỏ vào tất cả các giếng của đĩa, mỗi giếng 100µl dung dịch dừng phản ứng.
Bước 6: ðọc kết quả phản ứng
ðọc kết quả phản ứng trên máy đọc ELISA Titertek Multiskan Plus MKII, kính lọc 450nm. Kết quả phản ứng được phân tích dựa trên sự so sánh giá trị OD của huyết thanh đối chứng và OD của huyết thanh kiểm tra theo cơng thức sau:
ODM - ODN
Value (% ) = X 100% ODP - ODN
ODM: giá trị OD của mẫu huyết thanh kiểm tra. ODN : giá trị OD của mẫu huyết thanh đối chứng âm. ODP : giá trị OD của huyết thanh đối chứng dương.
Giá trị (%) < 20% 20% - 30% > 30% Kết quả Âm tính Nghi ngờ Dương tính
Khi kết quả xét nghiệm là dương tính, chúng ta kết luận trong huyết thanh của trâu bị kiểm tra cĩ kháng thể kháng virus LMLM do nhiễm virus tự nhiên. Như vậy, kết luận trâu bị kiểm tra đã bị nhiễm virus LMLM. Với
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 51
những mẫu nghi ngờ cần lấy máu xét nghiệm lại sau 15 ngày.
d. Sơ đồ đĩa phản ứng CHEKIT FMD – 3ABC – BO – PO dùng cho huyết thanh lợn.
Tương tự như sơ đồ phản ứng cuả CHEKIT FMD – 3ABC – BO – OV chỉ khác ở độ pha lỗng mẫu huyết thanh của lợn là 1:10. Và đọc kết quả ở bước sĩng 405nm. Cịn các bước tiến hành phản ứng thì tương tự.
3.3.5. Phương pháp Liquid Phase Blocking ELISA (LPB – ELISA)
a. Mục đích
Xác định sự cĩ mặt của kháng thể trong huyết thanh trâu bị sau tiêm phịng vacxin vơ hoạt nhũ dầu nhị giá typ O- Asia1.
b. Sơđồ đĩa phản ứng LPB – ELISA:
Mỗi serotype virus LMLM sẽ được kiểm tra trên từng đĩa phản ứng riêng. Phản ứng được tiến hành theo sơđồđĩa phản ứng sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 B C++ C++ 2 2 C C+ C+ 3 3 D C+ C+ 4 4 E C- C- 5 5 F C- C- 6 6 G Ca Ca 7 7 H Ca Ca 8 8 40 40
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 52
Chú thích: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C++ : Huyết thanh đối chứng dương mạnh C+ : Huyết thanh đối chứng dương yếu C- : Huyết thanh đối chứng âm
Ca : ðối chứng kháng nguyên
1,2,... 40 : Huyết thanh trâu, bị cần kiểm tra
c. Các bước tiến hành Bước 1: Coat đĩa (phủđĩa)
- Chuẩn bị kháng thể thỏ kháng virus LMLM tương ứng với các sertype O và Asia1. Pha lỗng mỗi loại kháng thể thỏ tương ứng với từng serotype O và Asia1 trong dung dịch Coating buffer theo tỷ lệ 1:500. Tính lượng dung dịch pha lỗng đủ dùng cho số đĩa ELISA sử dụng cho phản ứng. Nghĩa là mỗi đĩa ELISA cần Coat 5ml kháng thể thỏ pha lỗng thì khi pha cần dư thêm 1ml.
- Nhỏ vào tất cả các giếng của đĩa ELISA, mỗi giếng 50µl kháng thể thỏ pha lỗng.
- ðậy nắp, ủ và lắc đĩa trong tủấm 370C/1 giờ hoặc ủ qua đêm ở 40C.
Bước 2: Thực hiện phản ứng trung hồ trên đĩa nhựa polyropylen 96 giếng đáy chữ U
- Các loại huyết thanh đối chứng (C++, C+, C-) và huyết thanh cần kiểm tra được pha lỗng theo tỷ lệ 1:16 với Buffer A.
- Kháng nguyên virus LMLM chuẩn type O và Asia1 được pha lỗng trong Buffer A theo tỷ lệ 1: 100.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 53
+ Ở cột 1 – 2: nhỏ vào mỗi giếng 30µl huyết thanh đối chứng C++, C+, C- đã pha lỗng và 30µl dung dịch Buffer A ở các vị trí tương ứng theo sơ đồđĩa phản ứng (4giếng/loại).
+ Từ cột 3 – 12: Nhỏ vào mỗi giếng 30µl huyết thanh cần kiểm tra đã pha lỗng theo sơ đồđĩa phản ứng (2 giếng/loại).
+ Nhỏ vào tất cả các giếng của đĩa nhựa polypropylen, mỗi giếng 30µl kháng nguyên virus LMLM chuẩn type O – Asia1 pha lỗng.
+ Tiếp theo ủ hỗn hợp kháng nguyên – huyết thanh trong đĩa nhựa polypropylen qua đêm ở 40C.
Bước 3: Gắn mẫu vào đĩa ELISA đã Coat
- Rửa đĩa ELISA đã Coat 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M. - Chuyển 50µl hỗn hợp kháng nguyên – huyết thanh đã ủ từ đĩa nhựa chữ U sang đĩa ELISA theo vị trí tương ứng như sơ đồ đĩa phản ứng. ðậy nắp, ủ và lắc đĩa trong tủấm ở nhiệt độ 370C/1 giờ.
- Sau 1 giờ lấy đĩa ra và rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M.
Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện Guinea pig
- Kháng thể phát hiện Guinea pig tương ứng với các Serotype O và Asia1 được pha lỗng theo tỷ lệ 1:100 với Buffer B.
- Nhỏ vào các giếng của đĩa ELISA, mỗi giếng 50µl Guinea pig đã pha lỗng. ðậy nắp, ủ và lắc đĩa trong tủấm ở nhiệt độ 370C/1giờ.
- Sau 1 giờ lấy đĩa ra và rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M
Bước 5: Gắn Conjugate
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 54
- Nhỏ vào tất cả các giếng của đĩa ELISA, mỗi giếng 50µl Guinea pig đã pha lỗng. ðậy nắp, ủ và lắc đĩa trong tủấm ở nhệt độ 370C/40 phút.
- Sau 40 phút lấy đĩa ra và rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M.
Bước 6: Gắn Substrate TMB
- Pha lỗng TMB theo cơng thức: 9ml nước cất + 1 ml axit cetrixaxetat + 100 µl TMB + 1,3µl H202 30%.
- Nhỏ vào tất cả các giếng của đĩa ELISA, mỗi giếng 50µl Substrate TMB đã pha lỗng.
- ðể đĩa ELISA ở nhiệt độ phịng 15 – 20 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 7: Dừng phản ứng
Nhỏ vào tất cả các giếng của đĩa ELISA, mỗi giếng 50µl dung dịch H2SO4 1,25M để dừng phản ứng.
Bước 8: ðọc kết quả phản ứng.
- ðọc kết quả phản ứng trên máy đọc ELISA Titertek Multiskan Plus MKII, kính lọc 492nm. Sử dụng phần mềm EDI để tính PI (Percentage Inhibition).
- Cơng thức tính PI :
OD huyết thanh
PI = 100 – x 100 OD trung bình Ca
+ Nếu PI ≥ 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra được coi là dương tính, kết luận trong kiểm tra cĩ kháng thể LMLM.
+ Nếu PI < 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra được coi là âm tính, kết