3.3.1. đối tượng nghiên cứu
- Chó, mèo.
- Sán lá gan nhỏ C. sinensis.
- Một số loài cá nước ngọt là vật chủ bổ sung (cá mè, cá trắm, cá trôi, cá chép, cá diếc, cá rô, cá rô phi).
- Thuốc tẩy sán: Praziquantel, Niclosamid.
3.3.2. Dụng cụ, nguyên liệu nghiên cứu
- Dụng cụ: Kắnh hiển vi, phiến kắnh, lamen, pince, ựũa thuỷ tinh, lọ tiêu bản cổ nhỏ, giá lọc, vòng vớt, cốc nhựa, phễu, hộp lồng petri, buồng ựếm Mc masterẦ
- Nguyên liệu: Phân mèo, phân chó, nước lã, dung dịch tiêu cơ, cá.
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu
để thực hiện ựề tài, chúng tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng thường quy hiện ựang dược dụng tại các phòng thắ nghiệm ký sinh trùng trong và ngoài nước.
Thực hiện nghiên cứu ựề tài theo phương pháp nghiên cứu cắt ngang, lấy mẫu theo công thức dịch tễ học thú y:
2
2
1,96 .P.(1- P) d
n: Số mẫu cần lấy P : Tỷ lệ ước ựoán. d : Sai số ước lượng. Theo công thức trên :
- Với tỷ lệ ước ựoán chó, mèo mắc bệnh sán lá gan nhỏ là 20%. - Sai số ước lượng là 0,05.
- độ chắnh xác mong muốn là 95%.
Vậy số mẫu cần lấy ắt nhất ựể nghiên cứu với chó là 245,8 con ; làm tròn là 250 con. Tương tự với mèo là 250 con.
Chó, mèo nghiên cứu thuộc các lứa tuổi, phương thức chăn nuôi khác nhau tại 5 xã trong huyện Nghĩa Hưng tỉnh Nam định. Trong ựó mổ khám 63 chó, 63 mèo ; xét nghiệm 187 mẫu phân chó và 187 mẫu phân mèo.
điều tra tập quán ăn gỏi cá của người dân trong vùng nghiên cứu ựược thực hiện theo nghiên cứu cắt ngang. Số mẫu ựiều tra lấy theo công thức trên với số lượng mẫu cần lấy tối thiểu ựể ựiều tra là 250 người ở 5 xã trong huyện.
Tương tự số mẫu cá tối thiểu cần lấy ựể kiểm tra ấu trùng nang (Metacercaria) cho 7 loài cá là 500 con thuộc 5 xã trong vùng nghiên cứu.
* Phương pháp lấy mẫu phân
Lấy mẫu phân theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên ựơn giản.
- Lọ ựựng phân cần phải khô, sạch, bằng nhựa, thủy tinh hoặc giấy carton không thấm nước. Có miệng rộng, nắp vặn chặt. Có dán nhãn ựể ghi các thông tin về chủ hộ và gia súc.
- Lấy khoảng 10-15 gam phân mới thải hoặc lấy qua trực tràng của chó, mèo cho vào lọ ựựng mẫu. Vặn chặt nút lọ, ựiền ựầy ựủ các thông tin trên nhãn như: Tên chủ hộ, ựịa chỉ, loài gia súc, tuổi gia súc, tắnh biệt, tình trạng bệnh lý, ngày giờ lấy mẫu Ầ
- Mẫu phân cần phải ựược chuyển ngay về phòng thắ nghiệm ựể tiến hành các xét nghiệm [23].
* Phương pháp xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ
- Nguyên lý: Dựa vào sự chênh lệch tỷ trọng giữa trứng giun sán và nước, trứng giun sán có tỷ trọng nặng hơn tỷ trọng của nước nên sẽ chìm xuống ựáy cốc, từ ựó ta có thể tách ựược trứng giun sán ra khỏi phân nhờ kỹ thuật gạn rửa nhiều lần.
- Tiến hành: Lấy 10 - 15 gam phân của ựối tượng cần xét nghiệm ựể vào một cốc sạch, ựổ vào ựó một lượng nước sạch gấp 10 lần khối lượng phân. Dùng ựũa thuỷ tinh khuấy nát phân trong nước, lọc qua lưới lọc vào cốc nhựa (cốc nhựa có diện tắch ựáy nhỏ hơn diện tắch miệng), ựổ bỏ bã phân ở trên giá lọc. để yên tĩnh 5 - 10 phút, gạn bỏ lớp nước phắa trên, sau ựó lại tiếp tục ựổ nước sạch vào cặn lắng. Cứ làm như vậy 3 - 5 lần ựến khi cặn trở nên sạch, trong, lấy cặn ựó cho vào hộp lồng Petri soi dưới kắnh hiển vi có ựộ phóng ựại tối thiểu 100 lần ựể tìm trứng giun sán [7].
Phương pháp này cho phép người quan sát có thể tìm thấy trứng giun sán, ựặc biệt là trứng của các loài sán lá.
* Phương pháp xác ựịnh cường ựộ nhiễm trứng sán lá gan nhỏ
để xác ựịnh cường ựộ nghiễm trứng sán lá gan nhỏ trong một gam phân, chúng tôi thực hiện theo phương pháp ựếm trứng Mc. Master. Phương pháp ựược tiến hành như sau:
Lấy 2 gam phân khô (tương ựương 2 cm3) cho vào cốc hoặc bình thủy tinh, tiếp tục cho vào ựó 58 ml dung dịch nước muối bão hòa. Khuấy cho tan ựều, dùng pipet hút và bơm vào buồng ựếm Mc. Master (gồm 2 lam kắnh cách nhau 1,5 mm có hai buồng ựếm nhỏ gồm 6 ô, kắch thước mỗi buồng 1cm ừ 1 cm mặt trên). Sau khoảng 2 phút trứng ựược ựẩy lên buồng ựếm, ựếm tất cả trứng giun sán trong buồng ựếm (0,15 ml/1 buồng).
Tổng số trứng ựếm ựược
Số lượng trứng có trong 1 gam phân =
Số lượng buồng (2) ừ 200
* Phương pháp ựịnh loại trứng sán lá gan nhỏ
Chúng tôi ựịnh loại trứng sán lá gan nhỏ dựa theo phương pháp ựịnh loại của Monig (Trắch theo Trịnh Văn Thịnh - 1963).
* Phương pháp ựãi phân tìm sán
Phương pháp này thường ựược áp dụng cho các ựối tượng có lượng phân thải ra nhiều trong một lần (trâu, bò, lợn, chó, con người). Người ta thường dùng phương pháp này ựể ựánh giá thời gian cũng như hiệu quả của một loại thuốc tẩy giun sán nào ựó thông qua việc phát hiện lượng giun sán ựược tẩy ra nhiều hay ắt trong phân, thời gian xuất hiện những con sán ựầu tiên trong phân, thời gian xuất hiện những con sán cuối cùng trong phân của ựối tượng ựược ựãi phân.
Phương pháp ựược tiến hành như sau: Lấy toàn bộ bãi phân ựối với con người, chó, mèo. Lấy Ử ựến ơ ựối với phân trâu, bò, lợn của ựối tượng cần ựãi phân cho lên giá ựãi. Phân ựược ựãi trong nước lã cho ựến khi trong giá chỉ còn lại các cặn phân. Kiểm tra cặn phân có trong giá ựể ựếm số lượng sán tìm ựược.
* Phương pháp mổ khám phi toàn diện ựường tiêu hóa của chó, mèo
đây là phương pháp cho kết quả chắnh xác nhất, nó cho biết chắc chắn sự có mặt của giun sán ký sinh, cường ựộ nhiễm và các biến ựổi bệnh lý về mặt giải phẫu trong ựường tiêu hóa của chó mèo.
Sán lá gan nhỏ C. sinensis thường ký sinh ở gan và túi mật, một số trường hợp chúng ký sinh cả ở tuyến tụy của chó, mèo. Do ựặc tắnh ký sinh ựó nên khi mổ khám chúng tôi trú trọng chủ yếu tới 3 tổ chức trên, ngoài ra chúng tôi còn chú ý tìm sán và những biến ựổi giải phẫu ở ruột.
- Gan: Sau khi ựược tách khỏi xoang bụng, gan và mật ựược ựưa vào khay, mật ựược tách ra và ựể riêng. Gan ựược mổ dọc theo ựường ống dẫn mật ựể tìm sán. Những con sán ựược tìm thấy ựược cho vào ựĩa lồng Petri với nước muối 0,9%. Tổ chức gan còn lại ựược cắt thành miếng nhỏ ựem ngâm trong dung dịch nước muối 0,9% trong khoảng 10 phút, sau ựó bóp nát, lọc ựến khi nước trong tìm sán.
- Mật: Mổ mật, lấy dịch mật gan rửa sa lắng vài lần, ựến khi cặn trong, soi cặn trên kắnh hiển vi tìm trứng sán lá gan.
- Tụy: được mổ khám tương tự như gan, các ống tụy cũng ựược rạch dọc ựể tìm sán lá, ngoài ra tổ chức tụy cũng ựược cắt nhỏ, ngâm trong nước muối sinh lý khoảng 10 phút, sau ựó ựược bóp nát và gan rửa ựến khi cặn trong thì tìm sán lá.
* Phương pháp làm tiêu bản sán lá gan nhỏ
- Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm Carmine-axit clohidric (HCl): Lấy 5 gam Carmine nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 5 ml HCl và 5 ml nước cất. để yên sau 1 giờ, cho thêm 200 ml cồn 90o , lắc ựều, ựậy nút bông, ựun cách thủy cho tới khi Carmine tan hết, ựể một ngày sau lọc. Dung dịch ựể sau 1 tuần mới dùng.
- Tiến hành làm tiêu bản:
Nhuộm mẫu trong dung dịch Carmine axit: Tùy thuộc vào ựộ lớn của mẫu mà thời gian ựể mẫu trong dung dịch nhuộm có thể từ 5 phút ựến 1 giờ. Người ta dùng dung dịch cồn lẫn axit (100 ml cồn 80o , thêm vào 2-3 giọt HCl) ựể tẩy màu Carmine và làm rõ cấu tạo các chi tiết trong từ 1-10 phút tùy thuộc vào kắch thước mẫu.
Sau ựó rút nước trong cồn ở các nồng ựộ khác nhau (80o , 90o, 100o), thời gian trong mỗi loại cồn 5-7 phút, mẫu có kắch thước lớn thường ựể trong dung dịch lâu hơn. Sau ựó làm trong mẫu bằng dung dịch Xilen-cồn 100o theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 1-2 phút.
Cuối cùng lén tiêu bản bằng cách nhỏ lên tiêu bản 1-2 gọt bom Canada, ựặt mẫu ngay ngắn, ựậy lamen lại, ựể tiêu bản ở vị trắ nằm cho tới khi bom khô thì kết thúc làm tiêu bản [18].
* Phương pháp ựịnh loại sán lá gan nhỏ
để ựịnh loại sán lá gan nhỏ chúng tôi dựa vào hình thái cấu tạo của chúng thông qua tiêu bản nhuốm Carmine rồi so sánh với khóa phân loại của các tác giả Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê (1997).
* Phương pháp mổ cá tìm ấu trùng
- Phương pháp soi tươi Các bước tiến hành như sau:
Cân trọng lượng của cá bằng cân ựiện tử.
Lấy mẫu cơ, vây, mang, ruột cá cân bằng cân ựiện tử.
Mỗi loại mẫu ựược ép mỏng giữ hai phiến kắnh, kiểm tra dưới kắnh hiển vi có ựộ phóng ựại 200-400 lần tìm ấu trùng sán lá gan nhỏ.
- Phương pháp tiêu cơ Các bước tiến hành như sau:
Cân trọng lượng của cá bằng cân ựiện tử.
Lấy mẫu cơ, vây, mang, ruột cá cân trên cân ựiện tử ựể kiểm tra. Nghiền các mẫu riêng biệt bằng máy xay sinh tố.
Chuyển mẫu nghiền vào cốc thủy tinh 100 ml có chứa 50 ml dung dịch tiêu cơ (8 ml HCl + 6 gam pepsin + 1.000 ml nước cất), dung dịch tiêu cơ ngập 1/3 thể tắch mẫu.
Trộn ựầu mẫu và dung dịch tiêu cơ, ựặt mẫu trong tủ ấm 37oC trong 2-3 giờ, thỉnh thoảng khuấy ựều mẫu.
Thêm 50 ml nước cất, lắc và lắng, sau ựó lọc, lắng sản phẩm tiêu cơ qua lưới lọc 1ừ1 mm và rửa qua nước muối sinh lý, rồi ựể lắng cho ựến khi phần lắng cạn dễ quan sát.
Nhẹ nhàng loại bỏ phần nổi, giữ lại phần lắng cặn. Lặp lại 5-7 lần cho ựến khi lắng cặn trỏ lên trong.
Chuyển chất lắng cặn mỗi lần mọt lượng nhỏ và trong ựĩa lồng Petri chứa mọt ắt nước muối sinh lý.
Xoay nhẹ ựĩa Petri bằng tay sao cho các chất lắng cặn tập trung vào giữa. Dùng pipet loại bỏ phần nhẹ nổi trên bề mặt.
Quan sát phần lắng cặn trên kắnh hiển vi có ựộ phóng ựại 200-400 lần tìm ấu trùng sán lá gan nhỏ.
* Phương pháp ựịnh loại ấu trùng của C. sinensis
- định loại Metacercaria
Ấu trùng Metacercaria của sán lá gan nhỏ C. sinensis ựược chúng tôi ựịnh loại theo các nguồn tài liệu của đỗ Dương Thái, Trịnh Văn Thịnh (1978), Hà Ký, Bùi Quang Tề (2007).
* Phương pháp khảo sát tình hình ăn gỏi cá của người dân
Khảo sát tình hình ăn gỏi cá của người dân trong huyện chúng tôi dùng phương pháp ựiều tra thu thập thông tin qua phiếu ựiều tra.
* Thử nghiệm hiệu lực thuốc tẩy sán lá gan nhỏ
Thử nghiệm hiệu lực thuốc tẩy sán lá gan nhỏ theo phương pháp thực nghiệm.
* Phương pháp bố trắ thắ nghiệm
Khảo sát tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên ựàn chó, mèo tại ựịa ựiểm nghiên
cứu
+ Khảo sát tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên ựàn chó, mèo qua qua mổ khám
- Mỗi xã nghiên cứu chúng tôi tiến hành mổ khám 63 con mèo và 63 con chó theo phương pháp mổ khám phi toàn diện ở cơ quan tiêu hóa.
- Thu thập sán, làm tiêu bản, nhuộm Carmine, ựịnh loại sán theo nguồn tài liệu của các tác giả Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê (1977) và tắnh tỷ lệ cường ựộ nhiễm sán.
+ Khảo sát tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên ựàn chó, mèo qua kiểm tra phân
Mỗi xã chúng tôi lấy 187 mẫu phân mèo, 187 mẫu phân chó ở các ựộ tuổi và phương thức chăn nuôi khác nhau ựể làm xét nghiệm tìm trứng bằng phương pháp gạn rửa sa lắng.
Các chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ nhiễm.
- Cường ựộ nhiễm. - Nhiễm theo tuổi.
- Nhiễm theo phương thức chăn nuôi.
Khảo sát tập quán ăn gỏi tại ựịa ựiểm nghiên cứu
Mỗi xã chúng tôi tiến hành khảo sát 50 chủ hộ, không phân biệt nam, nữ. Các chỉ tiêu theo dõi:
- Có hay không ăn gỏi cá. - Mùa ăn gỏi cá.
- Mức ựộ ăn gỏi.
Khảo sát thành phần loài vật chủ bổ sung của sán lá gan nhỏ tại ựịa ựiểm nghiên cứu
để khảo sát thành phần loài vật chủ bổ sung, chúng tôi thu thập 500 cá thuộc 7 loài ở 5 xã trong huyện.
Các chỉ tiêu thep dõi:
-Tỷ lệ nhiễm ấu trùng ở các loài cá. - Cường ựộ nhiễm ấu trùng
- Nhiễm theo cơ quan, tổ chức cá
Thử nghiệm hiệu lực của thuốc tẩy sán lá gan nhỏ
- để thử nghiệm hiệu lực của thuốc tẩy sán lá gan nhỏ, chúng tôi sử dụng 12 chó, 12 mèo bị nhiễm sán lá gan nhỏ phát hiện qua xét nghiệm phân, bố trắ làm 2 lô, mỗi lô 12 con (6 chó và 6 mèo).
- Lô 1 dùng thuốc Praziquantel, liều 34mg/kg P, cho qua ựường thức ăn. - Lô 2 dùng thuốc Niclosamid, liều 50mg/kg P, cho qua ựường thức ăn. - Trước khi tẩy chúng tôi theo dõi một số chỉ tiêu lâm sàng: Thân nhiệt, hô hấp, trạng thái phân, trạng thái thần kinhẦ
- Sau tẩy 6-12 giờ, theo dõi lại các chỉ tiêu trên. - Thu thập thông tin và ựánh giá ựộ an toàn của thuốc.
- Sau khi cho chó, mèo dùng thuốc 8 giờ, theo dõi thu thập sán trong phân. - Sau khi cho chó, mèo dùng thuốc 72 giờ, mổ khám tìm sán trong ống mật. - Xác ựịnh hiệu lực tẩy trừ của thuốc qua tỷ lệ hiệu lực và tỷ lệ sạch sán.
3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thu ựược trong quá trình nghiên cứu, ựiều tra ựược chúng tôi ghi chép vào nhật ký. Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel của máy vi tắnh.
- Tỷ lệ nhiễm (tắnh theo %)
Số mẫu nhiễm
Tỷ lệ nhiễm = x 100
- Cường ựộ nhiễm sán trung bình
Số sán tìm ựược Cường ựộ nhiễm sán trung bình =
Số mẫu mổ khám
- Tỷ lệ hiệu lực của thuốc qua mổ khám (tắnh theo %)
Số sán tẩy ra Tỷ lệ hiệu lực = x 100 Tổng số sán thu ựược - Tỷ lệ sạch sán Số ựộng vật sạch sán Tỷ lệ sạch sán = x 100 Số ựộng vật mổ khám
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ TRÊN đÀN CHÓ, MÈO NUÔI TẠI HUYỆN NGHĨA HƯNG TỈNH NAM đỊNH NUÔI TẠI HUYỆN NGHĨA HƯNG TỈNH NAM đỊNH
4.1.1. Khảo sát tỷ lệ nhiễm sán lá gan trên ựàn chó mèo qua mổ khám
Bệnh sán lá gan nhỏ là bênh truyền lây giữa người và ựộng vật, ở người sán lá gan nhỏ gây bênh trầm trọng và ựể lại những hậu quả nặng nề. Ở ựộng vật bệnh không xảy ra ồ ạt mà tác ựộng một cách âm thầm dai dẳng và gây hại lớn, làm giảm hiệu qủa chăn nuôi.
Mặt khác, ở ựộng vật bệnh thường tồn tại ở thể mạn tắnh, con vật vẫn ăn uống, ựi lại tự do nhưng không ựược quản lý, vì vậy nó chắnh là yếu tố gieo dắc mầm bệnh và làm cho bệnh lây lan.
Với phương mổ khám phi toàn diện ở cơ quan tiêu hóa trên từng cá thể, ở xã chúng tôi tiến hành mổ khám 63 chó và 63 mèo. Kết quả chúng tôi xin trình bày ở bảng 1 và biểu ựồ 1.
Bảng 1: Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên ựàn chó, mèo nuôi tại huyện Nghĩa Hưng qua mổ khám
Trên ựàn chó Trên ựàn mèo
địa ựiểm nghiên cứu (xã) Số mẫu mổ khám (con) Số mẫu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Số mẫu mổ khám (con) Số mẫu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Nghĩa Thịnh 12 0 0,00 9 1 11,11