phân lập đ−ợc ở Việt Nam
* Quy trình chụp ảnh hình thái tế bào Chaetocerros sp. và Tetraselmis sp. CNT bằng kính hiển vi điện tử quét - Scanning Electronic Microscope (SEM)
Công việc chụp ảnh hình thái tế bào Chaetocerros sp. và Tetraselmis sp. CNT bằng kính hiển vi điện tử quét - SEM loại JEOL JSM-6400 (Nhật Bản) đ−ợc tiến hành tại Viện 69 - Bộ t− lệnh Lăng, Bộ Quốc Phòng.
- Quy trình chụp ảnh mẫu SEM đ−ợc tiến hành nh− sau (hình 2.2):
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 35
* Định tên khoa học loài Chaetoceros muelleri và Tetraselmis sp. dựa trên ph−ơng pháp xác định trình tự nucleotid của các gen 18S rRNA
Quy trình tách chiết ADN tổng số của VTB đ−ợc tiến hành nh− sau (hình 2.3):
0,5gam t−ơi hoặc 0,1 gam tảo khô đ−ợc cắt nhỏ 0,25cm2
Bổ sung vào 4ml Extraction bufer II và 0,2 mlβ -mecapthoethanol Đem ủ 56oC trong 10 phút
Sau đó lắc nhẹ mẫu ở 4oC trong 1 tiếng
Ly tâm 8000 v/p trong 5 phút
Thu lấy dịch trong chuyển sang ống epp mới
Tủa ADN bằng 0,1V 3M sodiumethanol acetate và 2V cồn tuyệt đối Ly tâm 12000 v/p trong 30 phút
Rửa tủa ADN bằng cồn 70% (lặp lại 2 lần) Làm khô ADN
Hình 2.3. Quy trình tách chiết ADN tổng số của VTB
- Gen 18S rRNA đ−ợc tách dòng theo các công bố của Đặng Diễm Hồng và cs., (2002, 2005; 2007); Andersen, (2005); Hoàng Lan Anh và cs., (2006); Ngô Hoài Thu và cs., 2005; Sambrook và Rusell, (2001). Trong đó:
+/ Đoạn gen 18S rRNA của Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. đ−ợc khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR đi từ ADN tổng số với cặp mồi Primer F&R có kích th−ớc dự
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 36
kiến là 1100bp do Phòng Công nghệ tảo, Viện CNSH thiết kế. Trình tự nucleotit của cặp mồi xuôi và mồi ng−ợc nh− sau:
U Pro18F: 5’-TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAG -3’ (24nu); U18R: 3’-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-5’ (22nu).
+/ Sản phẩm PCR đ−ợc tách dòng trong vectơ tách dòng pJET1. Sau khi tách dòng, ADN plasmit đ−ợc tinh sạch và xác định trình tự nucleotit trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM (R) 3100 - Avant Genetic Analyzer (USA) tại Viện Công nghệ sinh học.
+/ Trình tự nucleotit cửa toàn gen 18S rRNA thu đ−ợc từ AND tổng số sẽ đ−ợc sử dụng ch−ơng trình Clustal X Multiple Sequence Alignment Program (version 1.81, June 2000), DNAstar và MEGA3 để phân tích hệ số t−ơng đồng và mối quan hệ di truyền giữa các loài thuộc chi đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu với trình tự đ đ−ợc công bố trên ngân hàng GENEBANK. Dựa trên kết quả thu đ−ợc, xây dựng cây phát sinh chủng loại của loài thuộc chi Chaetoceros và Tetraselmis.