và so sánh trên trình tự nucleotit của gen 18S rRNA
* Tách chiết ADN tổng số
ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. đ−ợc tách chiết theo ph−ơng pháp của Đặng Diễm Hồng và cs., (1998). Kết quả điện di trên gel agarose 1% và đo ở b−ớc sóng 260 và 280nm cho chúng tôi thấy ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. thu đ−ợc là một băng sáng gọn, không bị đứt gy, có kích th−ớc t−ơng ứng khoảng 21kb, đảm bảo chất l−ợng sạch và đ−ợc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả tách ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. đ−ợc trình bày ở hình 3.4.
M 1 2
Hỡnh 3.4. Kết quả tỏch ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. và
Tetraselmis sp.
Giếng M: Thang ADN chuẩn 1 Kb Plus Ladder. Giếng 1: ADN tổng số của loài Tetraselmis sp. Giếng 2: ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. 21Kb
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 44
* Kết quả nhân gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp.
Dựa trên trình tự của gen 18S rRNA của các loài thuộc chi Chaetoceros và Tetraselmis, chúng tôi đ dùng cặp mồi đặc hiệu PrimerF và PrimerR do Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học tự thiết kế để nhân đoạn gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. với kích th−ớc t−ơng đ−ơng khoảng 1100 bp. Kết quả đ−ợc chỉ ra trên hình 3.5 cho thấy, sản phẩm PCR t−ơng đối đặc hiệu và có kích th−ớc đúng nh− dự kiến.
* Tách dòng đoạn gen 18S rRNA của Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. phân lập từ vùng biển Hải Phòng
Để tiến hành tách dòng và xác định trình tự nucleotit một phần gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. nghiên cứu, chúng tôi đ tiến hành thôi gen và tinh sạch sản phẩm PCR nhờ sử dụng kit Centrifuge (hng Promega-Mỹ). Sau đó sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đ−ợc tách dòng trong vectơ tách dòng pJET1 (Fermentas, Mỹ). ADN - plasmid của các dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp này đ−ợc tách chiết và đ−ợc tinh sạch qua cột GFX TM Micro Plasmit Prep Kit (hình 3.6). Kết quả thu đ−ợc cho thấy, ADN plasmit tái tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn có kích th−ớc t−ơng ứng khoảng 4,2 kb cao hơn so với kích th−ớc của vectơ pJET1 là 3,1 kb. Sau khi đ tinh sạch, ADN plasmit đ−ợc xác định trình tự.
1,65kb 1kb 2kb 0,85kb 1 2 3 1,1kb Hình 3.5. Kết quả nhân một phần gen 18S
rRNA của loài Chaetoceros sp., Tetraselmis
sp.
Giếng 1: Thang ADN chuẩn 1 Kb Plus Ladder. Giếng 2: Một phần ủoạn gen 18S rRNA của loài Tetraselmis sp.
Giếng 3: Một phần ủoạn gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 45
Sau khi trình tự nucleotit một phần gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. đ−ợc xác định, chúng tôi đ tiến hành so sánh các trình tự thu đ−ợc với trình tự gen 18S rRNA của 18 loài thuộc chi Chaetoceros và 10 loài thuộc chi Tetraselmis đ đ−ợc công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế (GenBank/DDBJ/EMBL) với sự hỗ trợ của các ch−ơng trình phần mềm DNAstar/ Clustal X và Paup 4.0 nhằm định tên các chủng giống Chaetoceros và Tetraselmis phân lập tại vùng bờ biển Hải Phòng. Dựa vào bảng tỉ lệ phần trăm t−ơng đồng và sơ
đồ mối quan hệ về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Chaetoceros và Tetraselmis, chúng tôi đ định tên chính xác 2 loài VTB nói trên (bảng 3.1; hình 3.7 và bảng 3.2; hình 3.8).
Hình 3.6. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmit tái
tổ hợp mang gen 18S rRNA của loài Tetraselmis sp. và
Chaetoceros sp.
Giếng 1: ADN plasmit của vectơ pJET1 đóng vòng, không mang gen
Giếng 2: ADN plasmit tái tổ hợp mang 1 phần gen 18S rRNA của Tetraselmis sp.
Giếng 3: ADN plasmit tái tổ hợp mang 1 phần gen 18S rRNA của Chaetoceros sp.
1 2 3
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 46
-Loài Chaetoceros sp.
Bảng 3.1. Hệ số t−ơng đồng của các loài thuộc chi Chaetoceros
Hình 3.7.Sơ đồ mối quan hệ về mặt di truyền giữa các loài thuộc chiChaetoceros
C.muelleri AY625896 C.calcitrans DQ887756 Chaetocerossp. C.gracilis AY625895 Chaetocerossp.GSL025 FJ546703 Chaetocerossp.NMBguh003-1 DQ88 Chaetocerossp.NMBguh003-2 DQ88 Chaetocerossp.AF145226 Chaetocerossp.NIOZ EF192996 C.neogracile EU090013 Chaetocerossp.ArM0005 C.socialis AY485446 C.rostratus X85391 Chaetocerossp.P442 AJ535167 Chaetocerossp.CCMP212 EF106785 C.calcitransf.pumilus AY625894 Chaetocerossp.IV14 EF473734 C.neogracile EU090012 Chaetocerossp.jonquieri DQ8309 0.02
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 47
Trình tự của đoạn gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. đọc đ−ợc là 1036bp. Tỉ lệ phần trăm t−ơng đồng của gen 18S rRNA của các loài thuộc chi Chaetoceros dao động trong khoảng từ 90,1% đến 100%. Loài Chaetoceros sp. có tỉ lệ phần trăm t−ơng đồng cao nhất là đối với loài C. muelleri (AY625896) là 99,7%,
tiếp đó là loài C. gracilis AY625895, loài C. calcitrans DQ887756 (đạt 99,6%) và thấp nhất là đối với loài Chaetoceros sp. ArM0005 (EU090014) đạt 88,7%. Dựa vào bảng tỉ lệ phần trăm t−ơng đồng và sơ đồ mối quan hệ về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Chaetoceros, chúng tôi kết luận rằng loài Chaetoceros sp. phân lập đ−ợc ở vùng biển Hải Phòng có thể là loài C. muelleri (AY625896) với hệ số phần trăm t−ơng đồng là 99,7%.
Kết hợp với kết quả chụp ảnh hình thái tế bào d−ới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét (SEM), chúng tôi nhận định loài Chaetoceros sp. phân lập từ vùng biển Hải Phòng chính là loài Chaetoeros muelleri, với hệ số t−ơng đồng cao nhất đạt 99,7% so với loài Chaetoceros muelleri (AY625896).
- Loài Tetraselmis sp.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 48
Đoạn trình tự của gen 18S rRNA của loài Tetraselmis sp. phân lập ở Hải Phòng có kích th−ớc 1044bp. Các loài thuộc chi Tetraselmis có hệ số phần trăm tuơng đồng cao, dao động trong khoảng từ 97,2% đến 99,7%. Loài Teraselmis sp. phân lập tại Hải Phòng có phần trăm t−ơng đồng cao nhất với loài T. convolutae (99,7%), tiếp theo là loài T. carterifomis và T. striata (99,4%), cuối cùng thấp nhất là loài T. sp. MBIC 11125 (97,2%)
Dựa vào bảng phần trăm t−ơng đồng và sơ đồ mối quan hệ về mặt di truyền giữa các loàithuộc chi Tetraselmis sp., chúng tôi kết luận rằng loài Tetraselmis sp. phân lập từ vùng biển Hải Phòng có thể là loài T. convolutae với phần trăm t−ơng đồng đạt 99,7%.
Kết hợp với kết quả phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái (chụp ảnh d−ới kính hiển vi quang học, kính hiển vi điệm tử quét), chúng tôi nhận thấy loài VTB Tetraselmis sp. phân lập từ vùng biển Hải Phòng có thể đ−ợc xếp vào loài Tetraselmis convolutae, với hệ số t−ơng đồng đạt 99,7% so với loài Tetraselmis
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 49
convolutae (U05039). Trình tự nucleotit của đoạn gen 18S rRNA của loài này cũng đ đ−ợc chúng tôi đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với m số FJ536748.