điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài tự nhiên theo định h−ớng ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng của các loài hải sản
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 40
Ph−ơng pháp nuôi từng mẻ, nuôi liên tục và nuôi bán liên tục đ−ợc tham khảo trong sách của Đặng Đình Kim, 2002 đ−ợc sơ đồ hoá theo hình 2.4.
Hình 2.4. Quy trình nhân nuôi sinh khối tảo trong điều kiện PTN và pilot 2.3.6. Ph−ơng pháp phân tích và xử lý số liệu
Các số liệu đ−ợc xử lý và phân tích theo ph−ơng pháp thống kê sinh học trên phần mềm SPSS, EXCELL...các ch−ơng trình máy tính chuyên dụng để phân tích trình tự gen, xây dựng sơ đồ mối quan hệ về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi
Chaetoceros và Tetraselmis, so sánh các trình tự nucleotit của các gen.
Nuôi trong bình tam giác 500 ml, 1 lít
Giống từ ống nghiệm
Nuôi trong bình tam giác 100 ml, 250 ml
Nuôi trong túi ny lông 50 lít, 80 lít Nuôi trong bình 5 lít, 10 lít
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 41
CHƯƠNG 3. KếT QUả NGHIÊN CứU Và THảO LUậN
3.1. Phân lập, l−u giữ, định tên khoa học chính xác loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. phân lập ở Việt Nam Tetraselmis sp. phân lập ở Việt Nam
3.1.1. Kết quả phân lập hai loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. từ vùng biển
Hải Phòng
* Loài Chaetoceros sp.
Sau 2 tháng nuôi cấy trên môi tr−ờng Erdschreiber lỏng, chúng tôi đ quan sát đ−ợc các tế bào tảo phát triển đ−ợc từ tế bào đ−ợc phân lập bằng micropipette. Quan sát d−ới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần, tế bào VTB phân lập đ−ợc từ vùng biển Hải Phòng có các đặc điểm nh− sau: tế bào hình chữ nhật, vuông hoặc hơi tròn, có lông gai ở các góc của tế bào, tế bào có chiều dài 10,52 ± 1,94 àm và chiều rộng 6,429 ± 1,374 àm, màu nâu vàng, tế bào có khả năng chuyển động hoặc đứng yên, chúng không có thành tế bào mà chỉ có màng tế bào bao bọc xung quanh nên tế bào của chúng rất dễ vỡ khi áp suất thẩm thấu thay đổi đột ngột. Dựa theo khoá phân loại của Tr−ơng Ngọc An, 1993 về các đặc điểm hình thái của các loài thuộc chi Chaetoceros, kết hợp với kết quả chụp ảnh d−ới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét (SEM) chúng tôi nhận định loài Chaetoceros sp. phân lập từ vùng biển Hải Phòng có thể là loài C. muelleri.
Hình 3.2. Hình thái tế bào Chaetoceros sp. d−ới kính hiển vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 5000 lần
5000 lần
Hình 3.1: Hình thái tế bào Chaetoceros
sp. d−ới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần
:
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 42
* Loài Tetraselmis sp.
Bằng ph−ơng pháp phân lập trên thạch, chúng tôi đ thu đ−ợc một số dòng tế bào vi tảo có một số đặc điểm nh− sau: tế bào có dạng đơn bào, có khả năng chuyển động nhờ hai roi, tế bào màu xanh, hình giọt lệ, có chiều dài 8,4 ± 1,0 àm và chiều rộng 4,8 ± 0,6 àm (hình 3.3a), có 2 roi ở đỉnh tế bào với chiều dài gần gấp đôi chiều dài thân (hình 3.3b). Những đặc điểm này t−ơng tự nh− các đặc điểm của các loài VTB thuộc chi Tetraselmis đ đ−ợc Okubo, 2000 công bố. Do đó, loài VTB phân lập từ vùng bờ biển Hải Phòng có thể đ−ợc xếp vào loài Tetraselmis sp.
Hiện nay, định tên theo ph−ơng pháp truyền thống chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái. Tuy nhiên, do các tế bào vi tảo có kích th−ớc rất nhỏ, chỉ vài àm nên việc định tên loài dựa vào các đặc điểm hình thái có một số khó khăn nhất định và đôi khi mang tính chủ quan. Ph−ơng pháp định tên bằng sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotit của một số gen bảo thủ nh−: 18S rRNA, ITS1-5,8S-ITS2, 28S rRNA (LSU) đ khắc phục đ−ợc những khó khăn của ph−ơng pháp trên và làm tăng độ tin cậy, chính xác cho ph−ơng pháp định tên. Do vậy, chúng tôi đ tiến hành ph−ơng pháp định tên Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. phân lập từ vùng biển Hải Phòng dựa trên việc so sánh trình tự nucleotit của đoạn gen 18S rRNA.
Hình 3.3b. Hình thái tế bào Tetraselmis sp. d−ới kính hiển vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 5000 lần
Hình 3.3a. Hình thái tế bào Tetraselmis
sp. d−ới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 l ần
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 43
3.1.2. Định tên khoa học chính xác ở mức độ sinh học phân tử của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. phân lập ở Việt Nam bằng ph−ơng pháp đọc Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. phân lập ở Việt Nam bằng ph−ơng pháp đọc và so sánh trên trình tự nucleotit của gen 18S rRNA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Tách chiết ADN tổng số
ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. đ−ợc tách chiết theo ph−ơng pháp của Đặng Diễm Hồng và cs., (1998). Kết quả điện di trên gel agarose 1% và đo ở b−ớc sóng 260 và 280nm cho chúng tôi thấy ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. thu đ−ợc là một băng sáng gọn, không bị đứt gy, có kích th−ớc t−ơng ứng khoảng 21kb, đảm bảo chất l−ợng sạch và đ−ợc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả tách ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. đ−ợc trình bày ở hình 3.4.
M 1 2
Hỡnh 3.4. Kết quả tỏch ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. và
Tetraselmis sp.
Giếng M: Thang ADN chuẩn 1 Kb Plus Ladder. Giếng 1: ADN tổng số của loài Tetraselmis sp. Giếng 2: ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. 21Kb
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 44
* Kết quả nhân gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp.
Dựa trên trình tự của gen 18S rRNA của các loài thuộc chi Chaetoceros và Tetraselmis, chúng tôi đ dùng cặp mồi đặc hiệu PrimerF và PrimerR do Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học tự thiết kế để nhân đoạn gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. với kích th−ớc t−ơng đ−ơng khoảng 1100 bp. Kết quả đ−ợc chỉ ra trên hình 3.5 cho thấy, sản phẩm PCR t−ơng đối đặc hiệu và có kích th−ớc đúng nh− dự kiến.
* Tách dòng đoạn gen 18S rRNA của Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. phân lập từ vùng biển Hải Phòng
Để tiến hành tách dòng và xác định trình tự nucleotit một phần gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. nghiên cứu, chúng tôi đ tiến hành thôi gen và tinh sạch sản phẩm PCR nhờ sử dụng kit Centrifuge (hng Promega-Mỹ). Sau đó sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đ−ợc tách dòng trong vectơ tách dòng pJET1 (Fermentas, Mỹ). ADN - plasmid của các dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp này đ−ợc tách chiết và đ−ợc tinh sạch qua cột GFX TM Micro Plasmit Prep Kit (hình 3.6). Kết quả thu đ−ợc cho thấy, ADN plasmit tái tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn có kích th−ớc t−ơng ứng khoảng 4,2 kb cao hơn so với kích th−ớc của vectơ pJET1 là 3,1 kb. Sau khi đ tinh sạch, ADN plasmit đ−ợc xác định trình tự.
1,65kb 1kb 2kb 0,85kb 1 2 3 1,1kb Hình 3.5. Kết quả nhân một phần gen 18S
rRNA của loài Chaetoceros sp., Tetraselmis
sp.
Giếng 1: Thang ADN chuẩn 1 Kb Plus Ladder. Giếng 2: Một phần ủoạn gen 18S rRNA của loài Tetraselmis sp.
Giếng 3: Một phần ủoạn gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 45
Sau khi trình tự nucleotit một phần gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. đ−ợc xác định, chúng tôi đ tiến hành so sánh các trình tự thu đ−ợc với trình tự gen 18S rRNA của 18 loài thuộc chi Chaetoceros và 10 loài thuộc chi Tetraselmis đ đ−ợc công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế (GenBank/DDBJ/EMBL) với sự hỗ trợ của các ch−ơng trình phần mềm DNAstar/ Clustal X và Paup 4.0 nhằm định tên các chủng giống Chaetoceros và Tetraselmis phân lập tại vùng bờ biển Hải Phòng. Dựa vào bảng tỉ lệ phần trăm t−ơng đồng và sơ
đồ mối quan hệ về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Chaetoceros và Tetraselmis, chúng tôi đ định tên chính xác 2 loài VTB nói trên (bảng 3.1; hình 3.7 và bảng 3.2; hình 3.8).
Hình 3.6. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmit tái
tổ hợp mang gen 18S rRNA của loài Tetraselmis sp. và
Chaetoceros sp.
Giếng 1: ADN plasmit của vectơ pJET1 đóng vòng, không mang gen
Giếng 2: ADN plasmit tái tổ hợp mang 1 phần gen 18S rRNA của Tetraselmis sp.
Giếng 3: ADN plasmit tái tổ hợp mang 1 phần gen 18S rRNA của Chaetoceros sp.
1 2 3
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 46
-Loài Chaetoceros sp.
Bảng 3.1. Hệ số t−ơng đồng của các loài thuộc chi Chaetoceros
Hình 3.7.Sơ đồ mối quan hệ về mặt di truyền giữa các loài thuộc chiChaetoceros (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C.muelleri AY625896 C.calcitrans DQ887756 Chaetocerossp. C.gracilis AY625895 Chaetocerossp.GSL025 FJ546703 Chaetocerossp.NMBguh003-1 DQ88 Chaetocerossp.NMBguh003-2 DQ88 Chaetocerossp.AF145226 Chaetocerossp.NIOZ EF192996 C.neogracile EU090013 Chaetocerossp.ArM0005 C.socialis AY485446 C.rostratus X85391 Chaetocerossp.P442 AJ535167 Chaetocerossp.CCMP212 EF106785 C.calcitransf.pumilus AY625894 Chaetocerossp.IV14 EF473734 C.neogracile EU090012 Chaetocerossp.jonquieri DQ8309 0.02
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 47
Trình tự của đoạn gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. đọc đ−ợc là 1036bp. Tỉ lệ phần trăm t−ơng đồng của gen 18S rRNA của các loài thuộc chi Chaetoceros dao động trong khoảng từ 90,1% đến 100%. Loài Chaetoceros sp. có tỉ lệ phần trăm t−ơng đồng cao nhất là đối với loài C. muelleri (AY625896) là 99,7%,
tiếp đó là loài C. gracilis AY625895, loài C. calcitrans DQ887756 (đạt 99,6%) và thấp nhất là đối với loài Chaetoceros sp. ArM0005 (EU090014) đạt 88,7%. Dựa vào bảng tỉ lệ phần trăm t−ơng đồng và sơ đồ mối quan hệ về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Chaetoceros, chúng tôi kết luận rằng loài Chaetoceros sp. phân lập đ−ợc ở vùng biển Hải Phòng có thể là loài C. muelleri (AY625896) với hệ số phần trăm t−ơng đồng là 99,7%.
Kết hợp với kết quả chụp ảnh hình thái tế bào d−ới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét (SEM), chúng tôi nhận định loài Chaetoceros sp. phân lập từ vùng biển Hải Phòng chính là loài Chaetoeros muelleri, với hệ số t−ơng đồng cao nhất đạt 99,7% so với loài Chaetoceros muelleri (AY625896).
- Loài Tetraselmis sp.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 48
Đoạn trình tự của gen 18S rRNA của loài Tetraselmis sp. phân lập ở Hải Phòng có kích th−ớc 1044bp. Các loài thuộc chi Tetraselmis có hệ số phần trăm tuơng đồng cao, dao động trong khoảng từ 97,2% đến 99,7%. Loài Teraselmis sp. phân lập tại Hải Phòng có phần trăm t−ơng đồng cao nhất với loài T. convolutae (99,7%), tiếp theo là loài T. carterifomis và T. striata (99,4%), cuối cùng thấp nhất là loài T. sp. MBIC 11125 (97,2%)
Dựa vào bảng phần trăm t−ơng đồng và sơ đồ mối quan hệ về mặt di truyền giữa các loàithuộc chi Tetraselmis sp., chúng tôi kết luận rằng loài Tetraselmis sp. phân lập từ vùng biển Hải Phòng có thể là loài T. convolutae với phần trăm t−ơng đồng đạt 99,7%.
Kết hợp với kết quả phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái (chụp ảnh d−ới kính hiển vi quang học, kính hiển vi điệm tử quét), chúng tôi nhận thấy loài VTB Tetraselmis sp. phân lập từ vùng biển Hải Phòng có thể đ−ợc xếp vào loài Tetraselmis convolutae, với hệ số t−ơng đồng đạt 99,7% so với loài Tetraselmis
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 49
convolutae (U05039). Trình tự nucleotit của đoạn gen 18S rRNA của loài này cũng đ đ−ợc chúng tôi đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với m số FJ536748.
3.1.3. L−u giữ và bảo quản Chaetoceros muelleri và Tetraselmis convolutae * L−u giữ Chaetoceros muelleri và Tetraselmis convolutae trên môi tr−ờng * L−u giữ Chaetoceros muelleri và Tetraselmis convolutae trên môi tr−ờng thạch ẩm
Loài Chaetoceros muelleri
Sau 1 tháng l−u giữ trên môi tr−ờng thạch ẩm, tế bào tảo C. muelleri qua quan sát d−ới kính hiển vi quang học cho thấy tế bào vẫn nguyên vẹn, còn roi, di động khoẻ, có màu nâu vàng (hình 3.9b). Kết quả đếm mật độ tế bào tr−ớc khi l−u giữ là 3,877
± 0,019 triệu tb/mL, sau l−u giữ là 2,8 ± 0,021 triệu tb/mL. Bên cạnh đó, lô đối chứng để nguyên không bổ sung môi tr−ờng tảo bị chết sau 1 tháng l−u giữ.
Loài Tetraselmis convolutae
Hình 3.9 a. Mẫu C. muelleri tại ngày ủặt
thí nghiệm lưu giữ thạch ẩm (09/02/2009) Hình 3.9 b. Mlưu giữ thẫạu ch C. muelleriẩm (09/03/2009) sau 1 tháng
Hình 3.10a. Mẫu Tetraselmisconvolutae tại ngày
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 50
Qua quan sát mẫu tảo Tetraselmis convolutae sau 1 tháng l−u giữ trên môi tr−ờng thạch ẩm, d−ới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần cho thấy tế bào vẫn nguyên vẹn, còn roi, di động khoẻ, có màu xanh (hình 3.10b). Kết quả đếm mật độ tế bào tr−ớc khi l−u giữ là 5,906 ± 0,015 triệu tb/mL, sau l−u giữ là 4,02 ±
0,012 triệu tb/mL. Ng−ợc lại, mẫu tảo Tetraselmis convolutae để nguyên không bổ sung môi tr−ờng sau 1 tháng l−u giữ đ bị chết.
* Bảo quản Tetraselmis convolutae ở nhiệt độ thấp - 80oC
Kết quả thí nghiệm về bảo quản Tetraselmisconvolutae ở nhiệt độ thấp - 80oC với các nồng độ chất bảo quản glycerol khác nhau đ−ợc chỉ ra trên hình 3.11 cho thấy tỷ lệ sống sót của tế bào ở lô có nồng độ glycerol là 19% cao nhất (đạt 97,9%) tiếp đến là lô - 16% (94,7%) và thấp nhất ở lô - 0% (13,5%). Theo kết quả nghiên cứu Fenwick &Day, (1992) cho rằng Tetraselmis suecica có thể bảo quản bằng chất glycerol với nồng độ 5 -15% ở nhiệt độ -196o tỷ lệ sống có thể đạt đến 74% và theo Canavate et al., (1997a) nghiên cứu cho thấy Tetraselmischuii có thể bảo quản bằng ở nhiệt độ -50oC xuống -196oC với tỷ lệ sống có thể đạt đến 100%. Kết quả thu đ−ợc tại thí nghiệm này của chúng tôi cho thấy có thể bảo quản Tetraselmisconvolutae ở nhiệt độ - 80oC với nồng độ glycerol là 19%.
Hình 3.11. Tỷ lệ sống sót của Tetraselmisconvolutae sau bảo quản ở - 80oC
với các nồng độ glycerol khác nhau 0 20 40 60 80 100 120 0% 7,3% 11% 16% 19% 22% Nồng ủộ Glycerol T ỷ l ệ s ố n g s ú t( % )
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 51
3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của loài C. muelleri và loài Tetraselmis convoluate phân lập ở Việt Nam Tetraselmis convoluate phân lập ở Việt Nam
3.2.1. Tối −u hoá điều kiện nuôi trồng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Nghiên cứu ảnh h−ởng của các điều kiện nuôi trồng nh− môi tr−ờng dinh d−ỡng, pH, nhiệt độ, độ mặn và c−ờng độ ánh sáng lên sinh tr−ởng của loài C. muelleri
- Môi tr−ờng nuôi cấy C. muelleri
Để xác định môi tr−ờng dinh d−ỡng tối −u cho loài C. muelleri, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên 3 môi tr−ờng nuôi cấy là Walne, F/2, Erd. Trong quá trình thí nghiệm, sinh tr−ởng của vi tảo đ−ợc xác định thông qua các thông số mật độ quang (OD680) và mật độ tế bào (MĐTB), TLK (hình 3.12).
Kết quả đ−ợc chỉ ra ở hình 3.12 cho thấy tốc độ sinh tr−ởng của C. muelleri sau 25 ngày nuôi cấy đạt cao nhất trên môi tr−ờng Erd tiếp theo là môi tr−ờng F/2 và cuối cùng là môi tr−ờng Walne t−ơng ứng với giá trị OD680 lần l−ợt là: 1,298 ±
0,048, 0,923 ± 0,007 và 0,772 ± 0,086 tại ngày nuôi thứ 22. Qua phân tích ANOVA và so sánh LSD0.05 cho thấy sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học giữa công thức môi tr−ờng Erd so với Walne và không có sự sai khác với môi tr−ờng F/2 (P<0,05).
Thí nghiệm nghiên cứu ảnh h−ởng của môi tr−ờng nuôi cấy lên sinh tr−ởng của
Hỡnh 3.12. Tốc ủộ sinh trưởng của C. muelleri theo giỏ trị OD680 trờn cỏc mụi trường khỏc nhau
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Walne F/2 Erd
Mụi trường nuụi OD
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 52
một số loài thuộc chi Chaetoceros nh− C. calcitrans; C. gracilis đều cho sinh tr−ởng