bò, nước chiết các loai rau củ hoặc ngũ cốc chứa ñựng nhiều chất hữu cơ và vô cơ tan trong nước có thể ñáp ứng ñược yêu cầu về dưỡng chất của một số
lớn vi sinh vật. Môi trường nuôi cấy tự nhiên có nhiều ưu ñiểm là rẻ tiền nhưng có nhược ñiểm không thể biết chính xác thành phần dinh dưỡng.
Môi trường nuôi cấy tổng hợp: Các thành phần dinh dưỡng của môi trường
ñược biết rõ và ñược kiểm soát về hàm lượng và chất lượng. Môi trường này cho phép người nuôi cấy vi sinh vật theo dõi một cách dễ dàng tác ñộng của chất dinh dưỡng ñối với vi sinh vật, ñặc biệt những loài vi sinh vật ñã ñược biết rõ. Tuy nhiên môi trường nuôi cấy tổng hợp thường rất ñắt tiền, chỉ sử
dụng cho từng loài vi sinh vật thích hợp, chuẩn bị khá phức tạp và tốn nhiều thời gian. [19, tr. 60]
* Môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong chế tạo vacxin:
ðể có thể thu ñược lượng giống là tế bào dinh dưỡng người ta thường tạo ñiều kiện môi trường nuôi cấy, thành phần môi trường ñảm bảo tối ưu cho sự sinh trưởng nhanh (tức là tăng về số lượng không tạo sản phẩm) trong trường hợp này sử dụng phương pháp nuôi cấy dịch thể (nuôi cấy chìm). [20, tr. 44]
Trong chế tạo vacxin, môi trường nuôi cấy vi sinh vật ñóng vai trò rất quan trọng. Thông thường các loại môi trường dùng trong sản xuất vacxin hiện nay là môi trường tự nhiên hỗn hợp, là sản phẩm của quá trình phân giải protein, gluxit hoặc là nước chiết của các tổ chức cơ thể ñộng vật như: cơ, gan, tim,... ; dịch chiết của cơ thể như: máu, huyết thanh ; sản phẩm của các
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 31 quá trình lên men sinh học sử dụng các nguyên liệu là thực vật như: mạch nha, mầm lúa, ngô, ñậu tương, tảo biển, cao nấm men....
Tại xí nghiệp thuốc thú y TW, các loại môi trường nuôi cấy vi trùng hiện nay ñều dựa trên quy trình chế tạo môi trường Hottinger cơ bản. Môi trường Hottinger ñược nhà khoa học người ðức có tên là Hottinger phát minh ra vào những năm ñầu thế kỷ XX. Cho ñến nay môi trường này vẫn ñang
ñược sử dụng rộng rãi trong ngành vi sinh vật ñặc biệt là trong chế tạo vacxin. Ngoài môi trường Hottinger còn có một số thành phần khác thường dùng ñể phối hợp cùng với môi trường Hottinger như: nước gan chiết xuất, nước thịt bò chiết xuất, nước dạ dày tiêu hoá, pepton, huyết thanh, máu... Các loại vi trùng khác nhau thì thành phần môi trường nuôi cấy sản xuất cũng khác nhau về tỷ lệ phối hợp các thành phần và ñộ pH môi trường thành phẩm.
Năm 1976, bác sỹ thú y Nguyễn Văn Lãm và cộng sựñã chế tạo thành công môi trường Hottinger từ ñậu phụ thay thế cho thịt bò và ñã thu ñược công môi trường Hottinger từ ñậu phụ thay thế cho thịt bò và ñã thu ñược những kết quả nhất ñịnh.
Hình 2.1. Mô tả quy trình chế tạo vacxin vi trùng
MT Hottinger Hottinger MT kiểm tra, kiểm nghiệm MT thành phẩm nhân giống SX Vacxin MT thạch thường MT nước thịt MT thạch máu MT nhân giống nhỏ MT nhân giống lớn sản xuMT ất Giống VSV C ấ y g i ố ng Xử lý canh trùng Ra chai Vacxin MT yếm khí
Kiểm tra thuần khiết, vô trùng Vacxin
thành phẩm MT giữ. nhân giống gốc VSV Kiểm nghiệm Vacxin
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 32 Sơ ñồ 2.1 cho thấy môi trường Hottinger ñóng một vai trò rất quan trọng khi tiến hành sản xuất vacxin. Từ môi trường cơ bản này người ta chế
tạo ra các loại môi trường thành phẩm nuôi cấy vi trùng như: môi trường giống nhỏ, giống lớn và môi trường sản xuất, các loại môi trường dùng trong kiểm tra và kiểm nghiệm khi sản xuất vacxin như: môi trường thạch thường, nước thịt ống, nước thịt lọ, nước thịt gan yếm khí, thạch máu, thạch ñếm số.
Chế tạo môi trường Hottinger chính là giai ñoạn tiêu hoá cơ chất (thuỷ
phân protein) dưới tác dụng của enzyme protease có trong tuỵ tạng của lợn ñể
tạo thành các axit amin (ñạm toan) và các peptid ñơn giản. Chính vì vậy hoạt ñộ
của enzyme protease ñóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình thuỷ phân cơ chất. Hoạt ñộ của enzyme là ñơn vịño lượng enzyme xúc tác quá trình phân giải hết 1 micromol cơ chất trong thời gian 1 giây ởñiều kiện tối ưu (ñược gọi là microkatal) . ðể xác ñịnh hoạt ñộ enzyme protease theo dược ñiển quy ñịnh phải tiến hành phân tách enzyme ra từng loại riêng biệt sau ñó tiến hành chuẩn ñộ
phản ứng thuỷ phân ở ñiều kiện tối ưu, sử dụng một loại cơ chất chuẩn (benzoylarginine ethyl este hydrochloride) có phân tử lượng xác ñịnh, sau ñó so sánh với hoạt ñộ của enzyme chuẩn theo dược ñiển quy ñịnh [46, tr. 1668-1669]. Thí nghiệm này rất khó thực hiện tại những cơ sở không có có ñủñiều kiện và trang thiết bị. Thay vì phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ enzyme theo dược ñiển, tại các cơ sở sản xuất người ta thường sử dụng phương pháp ñánh giá hoạt ñộ
enzyme dễ dàng thực hiện hơn do phương pháp này không ñòi hỏi các ñiều kiện quá khắt khe như phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ.
Hiện nay việc chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật ñã trở nên dễ dàng hơn khi trên thị trường có rất nhiều loại môi trường tổng hợp ñược chế sẵn dưới dạng bột, khi sử dụng chỉ cần cân khối lượng thích hợp hoà vào nước cất ñem lọc vô trùng hoặc hấp tiêu ñộc là có thể sử dụng ñược. Tuy nhiên giá thành của các loại môi trường này thường cao chỉ có thể áp dụng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm hoặc giữ giống vi sinh vật. Trong sản xuất ñại trà phần lớn vẫn phải chế tạo môi trường theo phương pháp truyền thống với nguyên liệu sẵn có.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 33 3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu
ðề tài ñược thực hiện tại Phòng hoá nghiệm, Phân xưởng vacxin vi trùng thuộc Xí nghiệp thuốc thú y T.W với các nội dung như sau:
3.1.1. ðánh giá khả năng tiêu hoá protein (hoạt ñộ) của enzyme protease có
trong tuỵ tạng lấy từ lợn giết mổ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.1.1. ðánh giá hoạt ñộ của enzyme protease có trong tuỵ tạng lợn ñược lấy sau khi giết mổ (tuỵ tươi). sau khi giết mổ (tuỵ tươi).
3.1.1.2. ðánh giá hoạt ñộ của enzyme protease có trong tuỵ tạng lợn ñược bảo quản ñông lạnh (-10o ÷ -12oC) tại các thời ñiểm sau: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 15, bảo quản ñông lạnh (-10o ÷ -12oC) tại các thời ñiểm sau: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 18 tuần.
3.1.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu hoạt ñộ enzyme protease trong tuỵ tạng
lợn vào việc chế tạo môi trường Hottinger sản xuất vacxin
Giai ñoạn (2007 – 2008): môi trường ñược sản xuất theo cách truyền thống: tỷ lệ sử dụng tuỵ tạng khi tiêu hoá cơ chất là cốñịnh = 0,13 (1,3 kg tuỵ
tạng + 10 kg thịt bò + 100 lit nước), enzyme protease có trong tuỵ tạng lợn chưa ñược kiểm tra ñánh giá hoạt ñộ trước khi chế tạo môi trường Hottinger.
Giai ñoạn (2009 – 2010): Enzyme protease có trong tuỵ tạng lợn trước khi sử dụng trong quá trình tiêu hoá protein chế tạo môi trường Hottinger ñã ñược
ñánh giá hoạt ñộ và xác ñịnh tỷ lệ phối hợp thích hợp giữa tuỵ tạng với cơ
chất (thịt bò).
3.1.2.1. So sánh các chỉ tiêu hoá nghiệm môi trường Hottinger ở hai giai
ñoạn SX: (2007 – 2008) và (2009 – 2010).
3.1.2.2. Khảo sát sự tương quan giữa các thành phần trong môi trường Hottinger ñược sản xuất ở hai giai ñoạn SX (2007 – 2008) và (2008 – 2009) Hottinger ñược sản xuất ở hai giai ñoạn SX (2007 – 2008) và (2008 – 2009)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 34 bằng phương trình hồi quy.
- Tương quan giữa hàm lượng ñam toan và tổng ñạm ở giai ñoạn SX (2007 – 2008) và (2009 – 2010)
- Tương quan giữa hàm lượng axit amin tryptophan và ñạm toan ở giai
ñoạn SX (2007 – 2008) và (2009 – 2010).
3.1.2.4. ðánh giá chất lượng môi trường Hottinger thông qua chỉ số vi sinh: khảo sát, so sánh số lượng vi trùng/ml canh trùng của các lô vacxin tụ huyết khảo sát, so sánh số lượng vi trùng/ml canh trùng của các lô vacxin tụ huyết trùng gia cầm tại thời ñiểm thu hoạch sản xuất ở hai giai ñoạn (2007 – 2008) và (2009 – 2010).
3.2. Nguyên liệu, hoá chất, dụng cụ nghiên cứu
3.2.1. Nguyên liệu
3.2.1.1. Tuy tạng lợn