- Phương pháp quang phổ kế:
Thường dùng ñể xác ñịnh hoạt ñộ các enzyme mà cơ chất, coenzyme, sản phẩm phản ứng có khả năng hấp thụ ánh sáng khác nhau ở những bước sóng xác ñịnh. Sự biến ñổi hấp thụ ở bước sóng ấy trong quá trình phản ứng là do hoạt ñộ enzyme. Phương pháp này ñược sử dụng rộng rãi ñể nghiên cứu các enzyme thuộc nhóm oxy hoá khử oxydoreductase, chẳng hạn:
+ Các dehydrogenase với coenzyme NAD+ hoặc NADP+. Tốc ñộ phản
ứng enzyme ñược xác ñịnh theo mức ñộ khử hoặc oxy hoá coenzyme của chúng. Dạng khử NADH, NADPH và dạng oxy hoá của các coenzyme này
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 17 khác nhau rõ rệt về khả năng hấp thụ bước sóng 340nm, sự biến ñổi này phản ánh mức ñộ chuyển hoá giữa hai dạng và cũng chính là tốc ñộ và hoạt ñộ phản
ứng enzyme.
Phương pháp này chỉ cần lượng nguyên liệu ít nhưng lại có ñộ nhậy rất cao cho phép xác ñịnh chính xác, nhanh chóng hoạt ñộ enzyme. Vì vậy ñây là một trong những phương pháp sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu enzyme học.
- Phương pháp chuẩn ñộ liên tục:
ðược dùng ñể nghiên cứu các phản ứng enzyme mà kết quả của nó tạo thành axit hoặc bazơ. Lúc ñó dùng thiết bị tự ñộng thêm kiềm hoặc axit vào
ñể giữ pH môi trường phản ứng cố ñịnh ñồng thời tự ñộng ghi ñường biểu diễn kiềm hoặc axit ñã tiêu tốn vào phản ứng trung hoà. Lưu lượng kiềm hoặc axit này phản ánh tốc ñộ phản ứng enzyme.
Phương pháp này có thểñược mô tả mở rộng ra ñể nghiên cứu các ñôi tượng khác nhưng trên nguyên tắc liên tục ñịnh lượng (sản phẩm tạo thành hay lượng cơ chất tiêu hao), chẳng hạn gián tiếp ño thế oxy hoá khử với ñiện cực tiêu chuẩn khi nghiên cứu các enzyme oxy hoá.
+ Phương pháp sắc ký:
ðây là phương pháp hiện ñại, hiện nay ñược sử dụng rất nhiều và trong nhiều trường hợp dùng tinh chế enzyme. Tất cả các phương pháp sắc ký ñều có thể áp dụng ñể xác ñịnh hoạt ñộ enzyme. Từ phương pháp lâu ñời nhất như
sắc ký giấy. sắc ký trao ñổi ion cho ñến các phương pháp hiện ñại như sắc ký lỏng cao áp, sắc ký kết hợp với các phương pháp phân tích hiện ñại khác (phân tích axit amin tự ñộng, cộng hưởng từ hạt nhân, cực phổ). Lượng enzyme và cơ chất cũng như sản phẩm phản ánh rất ít cũng cho kết quả chính xác, nhanh chóng.
+ Phương pháp hoá học:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 18 hụt hoặc sản phẩm phản ứng tạo thành dưới tác dụng của enzyme. Các phản
ứng này thuộc loại tạo màu ñặc trưng, tạo màu với thuốc thử ñặc trưng,... nói chung là một dấu hiệu ñể nói lên mức ñộ hay thời ñiểm kết thúc phản ứng. (ví dụ ñiểm tương ñương khi ñịnh phân axit bazơ ñược xác ñịnh bởi sự ñổi màu của phenolphtalein, quỳ tím...).
Trong tất cả các phương pháp nêu trên, tuỳ theo ñiều kiện, yêu cầu nghiên cứu thực tế mà quyết ñịnh phương thức tiến hành (chẳng hạn tiến hành trong ñiều kiện thời gian như nhau, hay nồng ñộ enzyme, nồng ñộ cơ chất không ñổi...) qui hoạch thực hiện ñể xác ñịnh các thông số tối ưu.
* Chuẩn bị dịch chiết enzyme ñể xác ñịnh hoạt ñộ:
Chế phẩm enzyme có thể ở dạng rắn, lỏng, bao gồm (cơ chất, chất
ñộn, hạt cốc), các bộ phận khác nhau của cơ thể sinh vật sinh enzyme (mô, tế bào, khuẩn ty, bào tử...) và môi trường sinh tổng hợp enzyme (chủ yếu là nước) có thể chứa cả enzyme trong ñó. Vì vậy cần phải xử lý nhằm lấy enzyme ñể xác ñịnh
- Với enzyme ngoại bào:
Nếu quá trình nuôi cấy hay tích luỹ enzyme bằng phương pháp bề sâu trong môi trường lỏng. Sau khi lấy mẫu xong cần làm lạnh nhanh chóng trong môi trường lỏng. Sau khi lấy mẫu xong cần làm lạnh nhanh chóng xuống 0oC rồi ly tâm tốc ñộ cao 5000 – 6000 vòng /phút ñể thu ñược dung dịch trong suốt.
Nếu quá trình nuôi cấy hay tích luỹ enzyme bằng phương pháp bề mặt trên môi trường rắn (hay hạt cốc) thì lấy mẫu 10-20 gam, chiết rút bằng dung trên môi trường rắn (hay hạt cốc) thì lấy mẫu 10-20 gam, chiết rút bằng dung dịch ñệm tương ứng với pH xác ñịnh trong ñiều kiện lạnh (OoC) ñể enzyme không bị biến tính hay giảm hoạt tính, lượng dung dịch này khoảng 200ml (gấp 10-20 lần chế phẩm). Lọc qua phễu hay ly tâm vắt ñể thu ñược dung dịch trong suốt.
- Với enzyme nội bào:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 19 + Phương pháp cơ học: Phổ biến nhất là nghiền (thông thường trong cối chày sứ, thuỷ tinh, máy nghiền quay tay, máy nghiền có ñộng cơ), nghiền với cát, vụn thuỷ tinh.
+ Phương pháp hoá sinh: dùng enzyme thích hợp (xenlulose, pectinase) ñể phân huỷ màng tế bào, mô ñể giải phóng enzyme (trước hết có thể nhận ñược tế bào trần rất có giá trị trong nghiên cứu tế bào học, enzyme học).
Tiếp ñó có thể dùng các phương pháp chiết rút thích hợp (dùng dung dịch ñệm, dùng (NH4)2SO4, axeton...) ñể nhận ñược dung dịch trong suốt.
Trong trường hợp sau khi xác ñịnh xong hoạt ñộ của dịch chiết cần tính toán hoạt ñộ của chế phẩm ban ñầu (quy về hàm lượng chất khô tuyệt
ñối). [17, tr. 68-72]
2.2. Dịch tuỵ và chức năng tiêu hoá:
Dịch tuỵ do tuyến tuỵ tiết ra theo ống dẫn tuỵ Wirsung ñổ vào tá tràng (chức năng ngoại tiết). Tuyến tuỵ có 1 hoặc hai ống dẫn riêng, chó và ngựa thường có hai ống dẫn. Dịch tuỵ có ý nghĩa rất quan trọng ñối với sự tiêu hoá: dịch tuỵ có tác dụng phân giải từ 60-80% protein, gluxit, lipit của thức ăn.
2.2.1. ðặc tính thành phần của dịch tuỵ:
- Dịch tuỵ tinh khiết là một chất lỏng trong suốt, không màu, tỷ trọng = 1,008- 1,010, có phản ứng kiềm pH = 7,8 - 8,4 (các loài gia súc khác nhau thì pH của dịch tuỵ khác nhau: ngựa: 7,3 - 7,58, lợn: 7,7 - 7,9, bò: 8,0). ðộ kiềm của dịch tuỵ tương ứng với ñộ axit của dịch vị. Nếu hỗn hợp hai loại này với nhau thì có thể thu ñược một dịch thể trung tính. ðộ kiềm của dịch tuỵ ñược
ñảm bảo nhờ các muối vô cơ, chủ yếu là NaHCO3. [22, tr. 135]