- Nhúm ủộ ct ố tế bào (Shiga /Verotoxin)
3. ðỐ IT ƯỢNG, NGUYấN LIỆU, NỘI DUNG
3.4.4. Phương phỏp xỏc ủị nh cỏc yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn Ẹ coli phõn lập ủược bằng phương phỏp PCR
Cú rất nhiều phương phỏp cú thể dựng ủể xỏc ủịnh ủộc tố ủường ruột (Enterotoxin) và khỏng nguyờn bỏm dớnh (Fimbriae) của vi khuẩn Ẹ coli. Hiện nay người ta dựng phương phỏp PCR ủể xỏc ủịnh cỏc loại ủộc tố và khỏng nguyờn bỏm dớnh, ủõy là phương phỏp ưu việt nhất về ủộ nhậy và tớnh chớnh xỏc của nú.
- Nguyờn tắc của phương phỏp PCR:
Tất cả cỏc DNA polymerase khi hoạt ủộng tổng hợp 1 mạch DNA mới từ mạch khuụn ủều cần cú sự hiện diện của những mồi chuyờn biệt. Mồi là những ủoạn DNA ngắn, cú khả năng bắt cặp bổ sung với một ủầu của mạch khuụn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi ủể hỡnh thành mạch mớị Phương phỏp PCR ủó ủược hỡnh thành dựa vào ủặc tớnh ủú của cỏc DNA polymerasẹ Vỡ vậy nếu ta cung cấp hai mồi chuyờn biệt bắt cặp bổ sung với hai ủầu của một trỡnh tự DNA, sẽ chỉ tổng hợp ủược ủoạn DNA nằm giữa hai mồi ủú.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ38 điều ủú cú nghĩa là ủể khuyếch ủại một trỡnh tự DNA xỏc ủịnh, ta phải cú thụng tin tối thiểu về trỡnh tự ủú ủủ ủể tạo cỏc mồi bổ sung chuyờn biệt. Cỏc mồi này gồm mồi xuụi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer). Từ xuụi và ngược ủược hiểu là xuụi và ngược so với chiều phiờn mó của gen.
* Cỏch tiến hành:
- DNA mẫu: khuẩn lạc vi khuẩn Ẹ coli mọc trờn mụi trường thạch mỏu ở 37oC/24h.
- Hỗn hợp phản ứng PCR: gồm
Primers: 1 àl mỗi loại
Dung dịch ủệm (5X): 5.0 àl Enzyme (Taq polymerase): 0.05 àl
Nước khử ion vừa ủủ ủể ủạt ủược thể tớch cuối cựng là 25 àl cho 1 phản ứng.
- Chu trỡnh của phản ứng PCR: phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhaụ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và ủược thực hiện trong mỏy nhõn gen tựủộng Perkin Elmer, theo sơủồ sau:
Chu trỡnh thứ nhất 30 chu trỡnh tiếp theo Chu trỡnh cuối Loại yếu tố gõy bệnh cần xỏc định Biến tớnh (oC/phỳt) Biến tớnh (oC/phỳt) Gắn mồi (oC/phỳt) Tổng hợp (oC/phỳt) Tổng hợp (oC/phỳt) STa, STb, LT 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 F4, F5, F6 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 F41, F18 94/5 94/1 50/1 72/1 72/7
- Chạy ủiện di: sản phẩm PCR thu ủược sau chu trỡnh phản ứng ủược nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) 0với mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ39 khi nhuộm, sản phẩm PCR ủược chạy ủiện di trờn thạch agarose 2% trong dung dịch ủệm TAE (Tris - Acetic - EDTA) với hiệu ủiện thế 100V trong vũng 40 phỳt. đõy là cỏch ủể cho cỏc ủoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương phỏp này dựa trờn nguyờn lý là cỏc phõn tử acid nucleic trong mụi trường pH trung tớnh thỡ tớch ủiện õm nhờ cỏc nhúm photphat nằm trờn khung phosphodiester của cỏc sợi nucleic. Khi ủặt chỳng vào ủiện trường, cỏc phõn tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phõn tớch trờn thạch agarose, cỏc phõn tử acid nucleic tựy theo kớch thước sẽ chuyển dịch với tốc ủộ khỏc nhau: loại phõn tử cú kớch thước lớn chạy chậm, loại cú kớch thước bộ chuyển dịch nhanh hơn.
- Nhuộm: gel thạch sau khi chạy ủiện di ủược nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1àl/ml) trong vũng 15 phỳt. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phõn tử của nú chui vào liờn kết giữa cỏc bazơ. Vị trớ cố ủịnh của cỏc nhúm cú khoảng cỏch gần với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với cỏc phõn tử BEt tự dọ
- đọc kết quả: bằng cỏch quan sỏt dưới ỏnh ủốn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trờn ảnh chụp nền ủen, cỏc ủoạn axit nucleic hiện lờn ở dạng băng màu trắng và cú thể chụp ảnh ủược và ghi nhận lạị Kớch thước cỏc băng DNA ủược so sỏnh với DNA chuẩn (DNA marker), ủược cho vào cựng lỳc với sản phẩm PCR ở một giếng riờng biệt, cạnh cỏc giếng dựng phỏt hiện cỏc sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dõy chuyền này mà người ta cú thể xỏc ủịnh ủược ủộ dài của ủoạn sản phẩm PCR.
3.4.5. Xỏc ủịnh serotyp khỏng nguyờn O của cỏc chủng vi khuẩn Ẹ coli phõn lập ủược bằng phản ứng ngưng kết nhanh trờn phiến kớnh