L ỜI CẢM ƠN
3.5.2.3.Phương pháp làm tiêu bản cố ñị nh
3. ðỊA ðIỂM ðỐI TƯỢNG NỘI DUNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
3.5.2.3.Phương pháp làm tiêu bản cố ñị nh
+ Tiêu bản sán lá, sán dây: nhuộm Carmin.
- Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm carmine-axit clohidric (HCl): lấy 5 g carmine nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 5ml HCl và 5ml nước cất, ñể yên sau 1 giờ, sau ñó cho thêm 200 ml cồn 900, lắc ñều, ñậy nút bông, ñun cách thuỷ cho tới khi carmine tan hết, ñể 1 ngày sau lọc. Dung dịch ñể sau 1 tuần mới dùng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………37
- Nhuộm mẫu: Nhuộm mẫu trong carmine axit. Tuỳ thuộc vào ñộ lớn của mẫu mà thời gian mẫu ñể trong dung dịch nhuộm có thể từ 5 phút ñến 1 giờ. ðể tẩy bớt màu carmine, làm rõ cấu tạo chi tiết, mẫu phải chuyển sang cồn-axit (100ml cồn 800, thêm vào 2 - 3 giọt HCl) với thời gian từ 1 - 10 phút tuỳ thuộc vào ñộ lớn của mẫụ Sau ñó rút nước trong cồn ở các nồng ñộ khác nhau: 800, 900, 1000, thời gian trong mỗi loại cồn từ 5 - 7 phút hoặc lâu hơn tuỳ thuộc vào kích thước, ñộ dày của mẫụ Mẫu có kích thước lớn thường ñể trong dung dịch lâu hơn. Sau ñó làm trong mẫu bằng dung dịch xylen + cồn 1000 theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian từ 1 - 2 phút. Cuối cùng lên tiêu bản bằng cách nhỏ lên lam kính sách 1 - 2 giọt bom Canada, ñặt mẫu vào cho ngay ngắn, nhỏ tiếp 1 giọt bom lên trên rồi ñậy lamen lạị ðể tiêu bản ở vị trí nằm cho tới khi bom trở nên khô thì tiêu bản ñã hoàn toàn ñảm bảọ
+ Tiêu bản giun tròn:
- Chuẩn bị dung dịch: Pha 3 loại dung dịch khác nhaụ
Dung dịch 1 gồm có cồn: glyxerin: nước cất với tỷ lệ là 20: 1: 79 (ml). Dung dịch 2 gồm có cồn: glyxerin với tỷ lệ là 5: 95 (ml).
Dung dịch 3 gồm có cồn: glyxerin với tỷ lệ là 50: 50 (ml). - Các bước tiến hành:
Lấy mẫu giun tròn ra cho vào dung dịch cồn khoảng 10 phút. Sau ñó mẫu ñược chuyển sang dung dịch 1, khay mẫu ñể trong tủ sấy ở nhiệt ñộ từ 380 - 400 trong 12 giờ. Chuyển mẫu sang khay có chứa dung dịch 2, khay mẫu ñể trong tủ sấy ở nhiệt ñộ từ 380 - 400 trong 12 giờ. Chuyển mẫu sang khay có chứa dung dịch 3, khay mẫu ñể trong tủ sấy ở nhiệt ñộ từ 380 - 400 trong 12 giờ. Khi mẫu ñã ñược làm trong, tiến hành lên tiêu bản parafin. Parafin ñun trên ngọn lửa ñèn cồn cho ñến khi nóng chảỵ Sau ñó dùng ống inox ñầu tròn nhúng vào dung dịch parafin rồi nhấc nhanh ñặt lên lam kính tạo thành vòng parafin, lưu ý tất cả dụng cụ như lam kính, lamen, kim nhọn ñều phải ñảm bảo
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………38
sạch và vòng parafin nên ñặt ở một phía của lam kính, phía còn lại dùng ñể ghi thông tin mẫụ Dùng kim nhọn lấy mẫu giun ñặt vào chính giữa vòng parafin, cho thêm 1 giọt glyxerin, lượng glyxerin tuỳ thuộc vào kích thước giun, cho ñến khi bao phủ ñược toàn bộ mẫụ ðặt lamen lên trên rồi hơ trên tấm sắt bên dưới có ñặt ñèn cồn. Hơ lam kính mẫu cho ñến khi parafin nóng chảy tràn ñều lamen và cho những giọt bọt khi trôi ra ngoàị Sau khi ñã hơ nóng, ñặt tiêu bản trên mặt phẳng chờ cho parafin ñông lạị Dùng chổi lông quét dọc theo viền lamen một lớp dung dịch bom Canada+xylen. ðể tiêu bản trên mặt phẳng tới khi xylen bay hơi thì tiêu bản ñã ñảm bảo ñể sử dụng.