L ỜI CẢM ƠN
3. ðỊA ðIỂM ðỐI TƯỢNG NỘI DUNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
3.5.1.5. Phương pháp ñị nh loại trứng giun sán
ðịnh loại trứng giun sán theo khố định loại của Mửnig (Trịnh Văn Thịnh, 1963) [33].
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………35
Với việc chẩn đốn giun sán đường tiêu hố trên gia súc chết thì mổ khám là phương pháp chính xác nhất, nĩ cho biết một cách chắc chắn các lồi giun sán ký sinh trong cơ thể, nĩ cịn cho ta biết về mức độ cảm nhiễm và những biến đổi về giải phẫu cũng như về bệnh lý học [5].
Tuỳ theo mục đích của việc chẩn đốn và tuỳđiều kiện cụ thể cĩ thể sử dụng nhiều phương pháp mổ khám khác nhaụ Sau đây là phương pháp mổ khám tìm giun sán đường tiêu hố của trâu, bị mà chúng tơi đã thực hiện.
3.5.2.1. Phương pháp mổ khám tồn diện ở một cơ quan
Buộc chặt các bộ phận thực quản, dạ dày (bao gồm dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ lá sách, dạ múi khế), ruột non, ruột già, manh tràng và gan, tuyến tụy, rồi tách ra và cho riêng vào thùng hoặc chậụ Sau đĩ thu mẫu giun sán ở từng nội quan đĩ [12].
+ Thực quản: Dùng kéo cắt dọc đường tiêu hĩạ Kiểm tra kĩ niêm mạc, nếu thấy sưng hoặc cĩ mủ thì kiểm tra kỹ nơi đĩ. Sau đĩ dùng dao giải phẫu hoặc phiến kính nạo niêm mạc tồn bộ thực quản, lần lượt cho lên phiến kính, ép giữa 2 phiến kính và kiểm tra bằng kính lúp hoặc kính hiển vị Nếu cĩ giun sán thì dùng kim hoặc bút lơng lấy giun rạ
+ Dạ dày: Kiểm tra riêng từng phần của dạ dàỵ Cắt dọc theo chiều cong của mỗi phần, lấy chất chứa cho vào thùng nước, sau đĩ rửa thành dạ dày, nước rửa và chất cặn bã cho vào cùng một thùng. Dùng đũa khuấy, đợi lắng cặn đổ nước ở trên đi, rồi lại thêm nước vào, khuấy lên, để yên, đợi lắng cặn .... làm nhiều lần, tới khi nước trong suốt là được. ðổ nước ở trên, lấy cặn lắng kiểm tra bằng kính lúp. Nếu chất cặn bã quá nhiều trong thời gian ngắn khơng làm xong thì cĩ thể dùng dung dịch formone ướp, kiểm tra dần.
+ Ruột non, ruột già và manh tràng: Kiểm tra riêng ba bộ phận. Dùng kéo cắt dọc theo chiều dài của ruột (khi cắt cần nâng mũi kéo lên để tránh cắt phải giun sán). Sau đĩ loại bỏ phân vào xơ nhỏ rồi gạn lọc liên tục tới khi
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………36
nước trong, gạn lấy phần lắng cặn kiểm tra bằng mắt thường và bằng kính lúp. Dùng tấm kính thuỷ tinh nạo nhẹ phần niêm mạc ruột, sau đĩ dùng phương pháp gạn lọc liên tục tới khi dung dịch trong thì lấy cặn để kiểm tra giun sán.
+ Gan: Tách mật ra cho vào hộp lồng để kiểm tra riêng, dùng phương pháp gạn rửa sa lắng để kiểm tra dịch mật. Cịn gan dùng tay bĩp nát, cũng gạn rửa sa lắng để kiểm trạ
+ Tuyến tụy: Dùng tay bĩp nát sau đĩ dùng phương pháp gạn rửa sa lắng để kiểm trạ
3.5.2.2. Cách thu lượm và bảo quản giun sán
Trong quá trình mổ khám, khi phát hiện được giun sán ta dùng bút lơng hoặc kim nhẹ nhàng tách giun sán ra rồi để chúng chết tự nhiên trong nước lã. Sau đĩ tuỳ lồi giun sán mà bảo quản trong các dung dịch khác nhaụ
Sán lá và sán dây được bảo quản trong cồn 700. ðối với giun trịn được bảo quản trong dung dịch Barbagallo gồm 30 ml Formol; 7,5 ml NaCl; nước cất vừa đủ 1000 ml.
Mỗi lọ bảo quản chỉ dùng bảo quản một loại giun sán nhất định ở một khí quan của một gia súc được mổ khám. Tất cảđược ghi chép rõ ràng và đầy đủ bao gồm: Lồi gia súc, tính biệt, tuổi, khí quan cĩ giun gián, tên lớp giun sán, số lượng, ngày tháng mổ khám, địa điểm và tên người thu lượm. Cĩ thể ghi thêm các biến đổi về giải phẫu, về bệnh lý đã quan sát được khi mổ khám.
3.5.2.3. Phương pháp làm tiêu bản cốđịnh
+ Tiêu bản sán lá, sán dây: nhuộm Carmin.
- Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm carmine-axit clohidric (HCl): lấy 5 g carmine nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 5ml HCl và 5ml nước cất, để yên sau 1 giờ, sau đĩ cho thêm 200 ml cồn 900, lắc đều, đậy nút bơng, đun cách thuỷ cho tới khi carmine tan hết, để 1 ngày sau lọc. Dung dịch để sau 1 tuần mới dùng.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………37
- Nhuộm mẫu: Nhuộm mẫu trong carmine axit. Tuỳ thuộc vào độ lớn của mẫu mà thời gian mẫu để trong dung dịch nhuộm cĩ thể từ 5 phút đến 1 giờ. ðể tẩy bớt màu carmine, làm rõ cấu tạo chi tiết, mẫu phải chuyển sang cồn-axit (100ml cồn 800, thêm vào 2 - 3 giọt HCl) với thời gian từ 1 - 10 phút tuỳ thuộc vào độ lớn của mẫụ Sau đĩ rút nước trong cồn ở các nồng độ khác nhau: 800, 900, 1000, thời gian trong mỗi loại cồn từ 5 - 7 phút hoặc lâu hơn tuỳ thuộc vào kích thước, độ dày của mẫụ Mẫu cĩ kích thước lớn thường để trong dung dịch lâu hơn. Sau đĩ làm trong mẫu bằng dung dịch xylen + cồn 1000 theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian từ 1 - 2 phút. Cuối cùng lên tiêu bản bằng cách nhỏ lên lam kính sách 1 - 2 giọt bom Canada, đặt mẫu vào cho ngay ngắn, nhỏ tiếp 1 giọt bom lên trên rồi đậy lamen lạị ðể tiêu bản ở vị trí nằm cho tới khi bom trở nên khơ thì tiêu bản đã hồn tồn đảm bảọ
+ Tiêu bản giun trịn:
- Chuẩn bị dung dịch: Pha 3 loại dung dịch khác nhaụ
Dung dịch 1 gồm cĩ cồn: glyxerin: nước cất với tỷ lệ là 20: 1: 79 (ml). Dung dịch 2 gồm cĩ cồn: glyxerin với tỷ lệ là 5: 95 (ml).
Dung dịch 3 gồm cĩ cồn: glyxerin với tỷ lệ là 50: 50 (ml). - Các bước tiến hành:
Lấy mẫu giun trịn ra cho vào dung dịch cồn khoảng 10 phút. Sau đĩ mẫu được chuyển sang dung dịch 1, khay mẫu để trong tủ sấy ở nhiệt độ từ 380 - 400 trong 12 giờ. Chuyển mẫu sang khay cĩ chứa dung dịch 2, khay mẫu để trong tủ sấy ở nhiệt độ từ 380 - 400 trong 12 giờ. Chuyển mẫu sang khay cĩ chứa dung dịch 3, khay mẫu để trong tủ sấy ở nhiệt độ từ 380 - 400 trong 12 giờ. Khi mẫu đã được làm trong, tiến hành lên tiêu bản parafin. Parafin đun trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nĩng chảỵ Sau đĩ dùng ống inox đầu trịn nhúng vào dung dịch parafin rồi nhấc nhanh đặt lên lam kính tạo thành vịng parafin, lưu ý tất cả dụng cụ như lam kính, lamen, kim nhọn đều phải đảm bảo
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………38
sạch và vịng parafin nên đặt ở một phía của lam kính, phía cịn lại dùng để ghi thơng tin mẫụ Dùng kim nhọn lấy mẫu giun đặt vào chính giữa vịng parafin, cho thêm 1 giọt glyxerin, lượng glyxerin tuỳ thuộc vào kích thước giun, cho đến khi bao phủ được tồn bộ mẫụ ðặt lamen lên trên rồi hơ trên tấm sắt bên dưới cĩ đặt đèn cồn. Hơ lam kính mẫu cho đến khi parafin nĩng chảy tràn đều lamen và cho những giọt bọt khi trơi ra ngồị Sau khi đã hơ nĩng, đặt tiêu bản trên mặt phẳng chờ cho parafin đơng lạị Dùng chổi lơng quét dọc theo viền lamen một lớp dung dịch bom Canada+xylen. ðể tiêu bản trên mặt phẳng tới khi xylen bay hơi thì tiêu bản đã đảm bảo để sử dụng.
3.5.2.4. ðịnh loại giun sán
ðo, vẽ dưới kính hiển vi thơng thường, định loại giun sán theo hình thái dựa vào tài liệu của Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ và Nguyễn Thị Lê (1977) [39]; Tài liệu của Nguyễn Thị Lê, Phan Văn Lực, Hà Duy Ngọ, Nguyễn Văn ðức, Nguyễn Thị Minh (1996) [19].
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu ốc ký chủ trung gian
3.5.3.1. Phương pháp thu mẫu ốc
ðể xác định được thành phần, số lượng 2 lồi ốc Lymnaea swinhoei và
Lymnaea viridis chúng tơi tiến hành tìm và đếm số lượng ốc bằng phương pháp thủ cơng.
- Dụng cụ thu mẫu: Vợt thu mẫu được thiết kế bằng cách dùng một giá inox với kích thước mắt là 18 mm gắn với một thanh sắt dài khoảng 2 - 3 m.
- Cách thu mẫu: Cĩ thể dùng vợt hoặc dùng tay thu mẫu ốc tuỳ vào điều kiện thủy vực. ðối với thủy vực là ao, mương hoặc ruộng lúa sâu thì tốt nhất là dùng vợt thu mẫụ Mẫu ốc được thu dọc theo bờ của ao, mương ngịi hoặc ruộng lúa bằng cách đưa vợt thu mẫu xuống đáy, sau đĩ nhấc lên sàng qua trong nước để loại bớt bùn (lưu ý khơng lấy quá sâu vì sẽ rất nhiều bùn), dùng tay nhặt bớt rác trong vợt rồi sau đĩ thu mẫu ốc. ðối với thuỷ vực là
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………39
mương, khe suối cĩ nhiều đá và ruộng lúa nơng thì dùng tay thu ốc là phương pháp tốt nhất.
Mẫu ốc thu được đựng trong lọ nhựa cĩ ghi nhãn rồi chuyển về phịng thí nghiệm của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật để xét nghiệm. Nếu xét nghiệm ngay sau đĩ thì lọ đựng mẫu ốc khơng đổ nước, cịn nếu xét nghiệm vài ngày sau đĩ thì nên cho vài ml nước vào lọđựng mẫu vì mẫu ốc thu được đựng trong lọ cĩ thể sống từ vài ngày đến 1 tuần.
3.5.3.2. Phương pháp định loại ốc
ðịnh loại ốc theo tài liệu của ðặng Ngọc Thanh, Thái Trần Bái, Phạm Văn Miên (1980) [30]
3.5.3.3. Phương pháp xét nghiệm ốc
Sử dụng 1 trong 3 phương pháp sau:
- Phương pháp ép: Áp dụng với những mẫu ốc nhỏ, cĩ vỏ mỏng và đặc biệt vào mùa đơng khi đĩ Cercaria chưa trưởng thành nên chưa chui ra ngồị ưu điểm của phương pháp này là cĩ thể nhận biết được các giai đoạn phát triển từrediađến Cercaria non trong cơ thểốc.
Sử dụng 2 tấm kính thuỷ tinh cĩ kích thước 10x20 cm. ðặt ốc vào giữa hai tấm kính, sau đĩ dùng tay ép nhẹ đến khi vỏ ốc vỡ rạ Cuối cùng đưa cả tấm kính mẫu kiểm tra ấu trùng sán lá dưới kính lúp giải phẫụ
- Phương pháp cắt ốc: Áp dụng với ốc cĩ vỏ cứng. ưu điểm của phương pháp này là cĩ thể nhận biết được các giai đoạn phát triển từ redia đến
Cercaria non trong cơ thể ốc. Nhỏ khoảng 10 giọt dung dịch sinh lý lên tấm kính thuỷ tinh cĩ kích thước 10x20 cm (nhỏ 10 giọt riêng biệt ở 10 vị trí khác nhau). Sau đĩ dùng kéo sắc cắt 1/3 từ phần chĩp ốc, rồi chấm phần cơ thể ốc cịn lại vào giọt nước để lấy phần dịch cơ thể ốc. Cứ thế làm riêng rẽ mỗi ốc với 1 giọt nước. Sau khi hồn tất kiểm tra mẫu chứa dịch cơ thểốc bằng kính lúp giải phẫu hoặc kính hiển vị
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………40
- Phương pháp để Cercaria chui ra tự do: Áp dụng cho tất cả các lồi ốc. Tuy nhiên phương pháp này chỉ cĩ thể quan sát được Cercaria trưởng thành. Nhược điểm của phương pháp này là nếu xét nghiệm ốc vào mùa đơng sẽ khơng cho kết quả chính xác vì đĩ là thời gian mà nhiều ấu trùng chưa phát triển đầy đủ thành Cercaria trưởng thành để chui ra ngồị Tiến hành bằng cách đặt từng cá thểốc vào một cốc nhỏ với vài ml nước, lượng nước tuỳ vào kích thước ốc, đổ nước cho đến khi ngập ốc. Sau đĩ để ít nhất 4 tiếng mới kiểm tra mẫu dưới kính lúp giải phẫụ
3.5.3.4. Phương pháp định loại ấu trùng sán lá
Sau khi phát hiện cĩ ấu trùng sán lá trong ốc, dùng pipet hút ra làm tiêu bản tạm thời, sau đĩ đo, vẽ, chụp Ảnh dưới kính hiển vi để cĩ thể định loạị Tồn bộ mẫu ấu trùng sán lá được định hình trong dung dịch cồn 70%.
So sánh hình thái, kích thước các ấu trùng thu được, định loại chúng theo tài liệu của Phạm Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê (2005) [4].
3.5.4. Phương pháp xác định trọng lượng trâu và bị
Chúng tơi tiến hành xác định trọng lượng trâu và bị áp dụng theo cơng thức tính trọng lượng của Nguyễn Văn Thiện (Viện Chăn Nuơi, 1974).
ðối với trâu: P = 88,4 x VN2 x DTC ðối với bị: P = 90,0 x VN2 x DTC Trong đĩ:
P: trọng lượng trâu, bị (kg).
VN2: vịng ngực bình phương (đo chu vi vịng ngực theo phương thẳng đứng ở sau xương bả vai), (m).
DTC: dài thân chéo (đo từ điểm trước của khớp bả vai đến điểm cuối cùng của u ngồi), (m).
Cơng thức cho phép sai số 5%.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………41
Nội dung 1: Khảo sát tình hình chăn nuơi trâu, bị ở tỉnh Sơn La trong giai đoạn hiện naỵ
Thu thập số liệu thống kê tình hình chăn nuơi trâu, bị tại các huyện của tỉnh Sơn La từ năm 2003 đến năm 2007 thơng qua Cục Thống kê Tỉnh.
Nội dung 2: Nghiên cứu tình hình nhiễm giun sán đường tiêu hố chủ yếu của trâu, bị qua xét nghiệm phân. Nội dung nghiên cứu được tiến hành tại 4 huyện thuộc 2 vùng sinh thái và 3 trang trại chăn nuơi bị.
Các vùng sinh thái là:
- Vùng I gồm 2 huyện Mộc Châu và Mai Sơn. - Vùng II gồm 2 huyện Thuận Châu và Sơng Mã. Các trang trại chăn nuơi bị là:
- Trại bị của cơng ty Hợp Lực ở thị xã Sơn Lạ
- Trại bị của cơng ty Trường Giang ở huyện Mai Sơn.
- Trại bị của Cơng ty cổ phần bị sữa Mộc Châu ở huyện Mộc Châụ Các chỉ tiêu cần theo dõi gồm:
- Tỷ lệ nhiễm giun sán đường tiêu hố chủ yếu ở trâu, bị tại các địa điểm nghiên cứụ
- Tỷ lệ nhiễm giun sán đường tiêu hố chủ yếu ở trâu, bị theo vùng sinh tháị
- Tình hình nhiễm các lớp giun sán đường tiêu hố ở trâu, bị.
- Thành phần lồi giun sán đường tiêu hố chủ yếu ở trâu, bị tại các địa điểm nghiên cứụ
Nội dung 3: Nghiên cứu tình hình nhiễm giun sán đường tiêu hố chủ yếu của trâu, bị qua mổ khám tại 4 huyện trong vùng nghiên cứu là Mộc Châu, Mai Sơn, Thuận Châu và Sơng Mã. Ở mỗi huyện chúng tơi tiến hành mổ khám tồn diện đường tiêu hố của 4 trâu và 2 bị.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………42
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm giun sán đường tiêu hố chủ yếu ở trâu, bị tại các địa điểm nghiên cứụ
- Thành phần lồi giun sán đường tiêu hố chủ yếu ở trâu, bị tại các địa điểm nghiên cứụ
Nội dung 4: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của sán lá gan
Fasciola spp. tại các địa điểm nghiên cứụ Nội dung nghiên cứu được tiến