3. đối t−ợng, nội dung, nguyên liệu
3.5.4. Ph−ơng pháp ELISA để đánh giá đáp ứng miễn dịch
kháng thể)
Nguyên liệu phản ứng:
- Kháng thể bẫy (trapping antibodies): chế huyết thanh thỏ kháng vi rút LMLM type O (chủng O1 Manisa) bằng cách tiêm bắp kháng nguyên tinh khiết 146S trộn với chất bổ trợ Freund. L−ợng tiêm 40 àg kháng nguyên 146S trong 1ml. Sau 28 ngày tiêm nhắc lại với l−ợng 20 àg kháng nguyên 146S. Sau 10 ngày lấy máu, chắt huyết thanh, và định l−ợng để chọn độ pha loãng tối −u dùng cho phản ứng.
lang kháng vi rút LMLM type O (chủng O1 Manisa) bằng cách tiêm bắp 20 àg kháng nguyên 146 S trộn với chất bổ trợ Freund. Sau 28 ngày lấy máu, chắt huyết thanh và chuẩn độ, tìm độ pha loãng tối −u. Gắn kháng huyết thanh chuột lang với huyết thanh bò sạch, không có miễn dịch (50% v/v).
- Kháng nguyên: vi rút LMLM chủng O1 Manisa đ−ợc nuôi cấy trên môi tr−ờng tế bào BHK-21. Khi có bệnh tích tế bào (CPE - Cytopathie Effect) hoàn toàn xảy ra, thu lấy dịch tế bào. Sau đó tinh khiết vi rút bằng cách ly tâm 2500 vòng/phút. Thu lấy n−ớc trong chứa vi rút. Vô hoạt vi rút bằng BEI (Binary ethyleneimine) 2% và bổ sung glycerine (20% v/v) bảo quản ở -20ºC.
- Conjugate: kháng huyết thanh thỏ (IgG - imuno globulin) kháng chuột lang đ−ợc cộng hợp với enzim Horseradish peroxidase. Conjugate đ−ợc block với huyết thanh bò sạch, không có miễn dịch (50% v/v).
- Substrate: oxy già (Hydrogen peroxide - H2O2).
- Chất phát màu (Chromogen): OPD - Ortho Phenylenediamine.
- Dung dịch đệm để gắn kháng huyết thanh thỏ kháng vi rút LMLM (coating buffer): dung dịch đệm Carbonate bicarbonate pH 9,5.
- Dung dịch đệm (buffer A) pha loãng huyết thanh và kháng nguyên (PBST): dung dịch đệm PBS 0,01M bổ sung 0,5% Tween 20 và phenol red 1%, pH 7,4 - 7,6.
- Dung dịch đệm (buffer B) block pha kháng huyết thanh chuột lang và conjugate: dung dịch PBST bổ sung 5% sữa tách bơ (skimmed milk).
- Dung dịch rửa: dung dịch đệm PBS 0,002 M, pH 7,4-7,6.
- Dung dịch đệm Citrate acetate 1 M, pH 5,6, để pha dung dịch phát màu. - Đĩa ELISA 96 lỗ, Nunc Maxisorp.
- Đĩa chữ U 96 lỗ polystyrene.
Tiến hành phản ứng LPB- ELISA
B−ớc 1: Gắn đĩa
Cho 50 àl kháng huyết thanh thỏ đã pha loãng vào mỗi lỗ trong đĩa ELISA. Đậy nắp ủ qua đêm hoặc ở 37ºC/1 giờ.
Sơ đồ phản ứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 B C++ C++ 1 1 C C+ C+ 1 1 D C+ C+ 1 1 E C- C- 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 F C- C- 2 2 10 10 G Ca Ca 2 2 10 10 H Ca Ca 2 2 10 10 B−ớc 2: trung hoà
- Trên đĩa nhựa chữ U 96 lỗ, pha loãng huyết thanh cần kiểm tra theo cơ số 2, bắt đầu từ độ pha loãng 1/16 và kết thúc ở độ pha loãng 1/128, 30 àl mỗi lỗ.
- Pha loãng kháng nguyên vi rút LMLM type O1 Manisa 1/70. Nhỏ 30
àl kháng nguyên đã pha loãng vào tất cả các lỗ. Nh− vậy huyết thanh kiểm tra lúc này có độ pha loãng là 1/32, 1/64, 1/128, 1/256. ủ đĩa nhựa ở 4ºC qua đêm. Trong mỗi đĩa đều có đối chứng d−ơng mạnh, d−ơng yếu, đối chứng âm tính và đối chứng kháng nguyên Ca (chỉ có kháng nguyên và PBST).
B−ớc 3: gắn mẫu vào đĩa phản ứng
Rửa đĩa phản ứng 3 lần bằng dung dịch rửa, thấm khô. Sau khi rửa đĩa chuyển 50 àl hỗn hợp huyết thanh/kháng nguyên từ đĩa chữ u sang đĩa ELISA theo vị trí t−ơng ứng. Lắc, ủ ở 37ºC trong 1 giờ.
B−ớc 4: gắn kháng thể phát hiện
Rửa đĩa phản ứng 3 lần, nhỏ vào mỗi lỗ của đĩa 50 àl kháng huyết thanh chuột lang kháng vi rút LMLM đã d−ợc pha loãng tỷ lệ1/100 bằng dung dịch PBST bổ sung sữa tách bơ. Lắc ủ ở nhiệt độ 37ºC trong 1 giờ.
B−ớc 5: gắn conjugate
Rửa đĩa phản ứng 3 lần, nhỏ vào mỗi lỗ của đĩa 50 àl conjugate đã pha loãng 1/200. Lắc, ủ ở nhiệt độ 37ºC trong 1 giờ.
B−ớc 6: cho cơ chất (Substrate/chromogen):
Rửa đĩa phản ứng 3 lần, nhỏ vào mỗi lỗ 50 àl dung dịch substrate/chromogen tỷ lệ 1/200 (dung dịch ODP trong citrate acetate bổ sung 0,5% H2O2). Để ở nhiệt độ phòng trong chỗ tối, thời gian từ 20 - 30 phút. B−ớc 7: dừng phản ứng
Cho vào mỗi lỗ 50 àl dung dịch H2SO4 1,25 M.
Đọc kết quả: sử dụng máy đọc ELISA ch−ơng trình Program number 1 ở b−ớc sóng 492 nm.
* Tính kết quả:
Từ kết quả đọc ở máy ta có OD (Optical Density - đậm độ quang học) của huyết thanh. Từ OD ta tính đ−ợc PI (Percentage Inhibition - phần trăm ức chế mẫu). Mẫu huyết thanh nào có PI ≥ 50 đ−ợc coi là d−ơng tính (có kháng thể kháng vi rút LMLM).
Có thể đọc và tính kết quả tự động từ máy tính bằng phần mềm EDI 2.2. Công thức PI đ−ợc tính nh− sau:
OD mẫu xét nghiệm PI = 100 -