3. đối t−ợng, nội dung, nguyên liệu
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Đánh giá tình hình dịch LMLM năm 2006 3.2.2. Tình hình dịch bệnh tại xí nghiệp.
Một số chỉ tiêu năng suất của xí nghiệp. Quy trình phòng bệnh tại xí nghiệp. Tình hình dịch bệnh của đàn nái ông bà.
3.2.3. Khảo sát diễn biến đáp ứng miễn dịch của đàn lợn sau khi tiêm vắc xin LMLM. (Ph−ơng pháp Elisa phát hiện kháng thể) xin LMLM. (Ph−ơng pháp Elisa phát hiện kháng thể)
Khảo sát đáp ứng miễn dịch của đàn nái mẹ sau khi tiêm vắc xin.
Khảo sát diễn biến hiệu giá kháng thể thụ động ở lợn con sinh ra từ nái mẹ đã tiêm phòng vắc xin LMLM.
Khảo sát đáp ứng miễn dịch của đàn lợn choai sau khi tiêm vắc xin 1 lần.
Khảo sát đáp ứng miễn dịch của đàn lợn choai sau khi tiêm vắc xin liều tăng c−ờng.
Chẩn đoán phân biệt kháng thể bằng kít 3 ABC.
3.2.4. Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng vắc xin phòng bệnh LMLM, so sánh với biện pháp tổng thể sánh với biện pháp tổng thể
3.3. địa điểm nghiên cứu
Xí nghiệp giống gia súc - gia cầm Thuận Thành, Bắc Ninh.
Phòng thí nghiệm Vi rút, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng.
3.4. nguyên liệu
3.4.1. Dụng cụ
ống đong các cỡ.
- Pipet thuỷ tinh các cỡ.
- Miro pipet các cỡ (1 và 12 kênh). - Đầu týp nhựa các cỡ dùng cho pipet.
- Đĩa nhựa Nunc Immunoplate 1, Maxirorp (Gibco, Cat # 4-39454A) đáy bằng, 96 lỗ.
- Đĩa nhựa polystyren 96 lỗ chữ U.
- Dao, kéo, panh kẹp, cối chày sứ, cát vô trùng. - Giá cố định gia súc.
- Kim lấy máu ( kim hai đầu có ống chân không). - Bông thấm và không thấm n−ớc. - Dung dịch PBS 0,04M, pH =7,2 - 7,6 và Glycerin. - Lọ 20 - 24 ml, có nút vặn, vô trùng. - Thuốc sát trùng: cồn iode, cồn 70º. - Hộp nhôm đựng bệnh phẩm, đá lạnh. - Hộp cát tông, nhãn để gắn ngoài lọ bệnh phẩm. 3.4.2. Máy móc thiết bị: - Tủ lạnh âm sâu, tủ lạnh th−ờng. - Tủ ấm, tủ sấy. - Cân phân tích (độ chính xác +/- 0,1g). - Máy đọc ELISA. - Máy lắc đĩa.
3.4.3. Nguyên liệu làm thí nghiệm
- Vắc xin Posi - FMD (Pfizer - USA).
- Bộ kít ELISA phát hiện kháng thể kháng vi rút LMLM của phòng thí nghiệm tham chiếu Pirbright (IAH -WRL).
- Bộ kit ELISA phát hiện và định type kháng nguyên của phòng thí nghiệm tham chiếu Pirbright (IAH - WRL).
- Kít ELSA CHEKIT-FMD -3ABC BO-OV do Bommeli Diagnostics (Thụy Sỹ) sản xuất.
- Mẫu huyết thanh lợn lấy tại xí nghiệp giống gia súc gia cầm Thuận Thành. Nguyên liệu khác:
- Thông tin, các báo cáo của Chi cục Thú y Bắc Ninh và các trạm Thú y huyện, thị xã trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh.
- Số liệu điều tra các điều kiện tự nhiên, kinh tế và xã hội đ−ợc thông qua Chi cục Thống kê tỉnh Bắc Ninh.
3.5. ph−ơng pháp nghiên cứu
3.5.1. Bố trí thí nghiêm
Thí nghiệm tiến hành tiêm phòng vắc xin LMLM tại đàn lợn nái và lợn con giống tại Xí nghiệp giống gia súc - gia cầm huyện Thuận Thành tỉnh Bắc Ninh. Lấy máu lợn nái đ−ợc tiêm vắc xin LMLM để kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng vi rút LMLM tại các thời điểm: tr−ớc khi tiêm vắc xin; sau khi tiêm vắc xin 21 ngày; sau khi tiêm vắc xin 60 ngày; sau khi tiêm vắc xin 120 ngày.
Lấy máu lợn con đ−ợc sinh ra từ đàn nái mẹ đã đ−ợc tiêm vắc xin để kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng vi rút LMLM tại các thời điểm: sau khi sinh 1 ngày, sau khi sinh 21 ngày, sau khi sinh 60 ngày.
Lấy máu lợn choai đ−ợc tiêm vắc xin LMLM để kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng vi rút LMLM. Với lô tiêm vắc xin 1 lần lấy mẫu tr−ớc khi
tiêm vắc xin; sau khi tiêm vắc xin 21 ngày; sau khi tiêm vắc xin 60 ngày; sau khi tiêm vắc xin 120 ngày.
Với lô tiêm liều tăng c−ờng sau mũi đầu 1 tháng, tiến hành lấy mẫu sau khi tiêm vắc xin liều tăng c−ờng 21 ngày; sau khi tiêm vắc xin 60 ngày; sau khi tiêm vắc xin 120 ngày.
3.5.2. Ph−ơng pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm
- Quy trình tiêm phòng vắc xin của trại:
- Với đàn nái và đực giống: tiêm 2 lần/năm vào các tháng t− và tháng m−ời. - Với đàn lợn con: Tiêm phòng lúc đạt 60 ngày tuổi.
- Liều l−ợng: 2ml/con/1lần. Tiêm bắp hoặc tiêm d−ới da.
Ph−ơng pháp lấy máu
- Với lợn choai lớn và nái dùng tròng mõm để cố định lợn vào thành chuồng. - Với lợn con và lợn choai đặt nằm ngửa cố định trên kệ.
- Vị trí lấy máu tốt nhất là lấy tĩnh mạch cổ, sau khi cố định gia súc, cắt lông, sát trùng chỗ tĩnh mạch cổ, chờ chất sát trùng khô thì lấy máu. Có thể dùng dây garo thắt vào 2/3 d−ới cổ để tĩnh mạch nổi rõ.
- Cách lấy máu: dùng ống chân không có kim hai đầu hoặc syringe để lấy máu tĩnh mạch cổ, l−ợng máu ít nhất từ 2 đến 5 ml. Sau khi lấy máu, để nghiêng ống nghiệm một góc 45º ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 2 giờ, sau đó chắt huyết thanh vào lọ thuỷ tinh hay lọ nhựa 2ml vô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong điều kiện lạnh.
Lấy huyết thanh
Các mẫu đều đ−ợc đánh dấu ghi nhãn với các chỉ tiêu: số thẻ nái, số xăm tai con; trạng thái sinh lý; tình trạng sức khoẻ; ngày lấy mẫu; ng−ời lấy mẫu.
Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm.
Mẫu máu đặt trong thùng nhôm kín, thùng nhôm đặt trong hộp xốp có đá lạnh. Bệnh phẩm đ−ợc chuyển về phòng xét nghiệm càng nhanh càng tốt.
Bệnh phẩm là dịch hầu, nếu ch−a tiến hành xét nghiệm có thể bảo quản ở nhiệt độ âm sâu (-20 đến -45ºC), với mẫu là huyết thanh bảo quản nhiệt độ 2 đến 4ºC nh−ng cần tiến hành xét nghiệm sớm nếu để lâu hiệu quả giảm.
3.5.3. Ph−ơng pháp ELISA – 3 ABC để phân biệt miễn dịch tự nhiên và miễn dịch bị động tự nhiên
3.5.3.1. Cơ sở khoa học
Khi vi rút LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc móng chẵn, quá trình nhân lên của vi rút sẽ diễn ra. Trong quá trình này, vi rút vừa tạo ra các thành phần để tái tạo các hạt vi rút mới (các virion), vừa tạo ra các thành phần không tham gia tạo thành các hạt virion mới mà chỉ đóng vai trò các men giúp cho quá trình nhân bản. Các thành phần kết hợp thành bản thân vi rút có tính kháng nguyên gọi là protein cấu trúc (structure protein). Các thành phần không tham gia kết hợp thành virion mới và có tính kháng nguyên gọi là protein không cấu trúc (non- structure protein) [30].
Trong các protein không cấu trúc của vi rút LMLM thì kháng nguyên 3ABC có tính kháng nguyên rất cao, nó kích thích cơ thể gia súc tạo ra kháng thể đặc hiệu với số l−ợng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bò bị nhiễm. Do đó việc phát hiện kháng thể đặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc đang bị nhiễm vi rút LMLM.
Hiện nay n−ớc ta đang sử dụng vắc xin LMLM nhập từ hãng Intervet (Hà Lan), Merial (Pháp) và Pfizer (Mỹ). Những loại vắc xin này là vô hoạt và đã loại bỏ những kháng nguyên không cấu trúc. Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt vi rút) chứ không có kháng thể kháng lại kháng nguyên không cấu trúc 3ABC. Do đó, dùng phản ứng ELISA sẽ phát hiện đ−ợc gia súc nhiễm vi rút LMLM, kể cả những con đã đ−ợc tiêm phòng.
3.5.3.2. Nguyên liệu
+ Đĩa ELISA đ−ợc phủ kháng nguyên 3ABC của vi rút LMLM, kháng nguyên có độ tinh khiết cao đ−ợc sản xuất bằng ph−ơng pháp tái tổ hợp.
+ CHEKIT - Anti-IgG-PO-Conjugate (conjugate).
+ CHEKIT - washing&dilution-solution (dung dịch rửa). + CHEKIT - chromogen (cơ chất).
+ Huyết thanh âm chuẩn. + Huyết thanh d−ơng chuẩn. + Huyết thanh lợn cần chẩn đoán.
3.5.3.3. Các b−ớc tiến hành Sơ đồ xét nghiệm + + + + + + + + + + + + A N N 7 7 B P P 8 8 C 1 1 9 9 D 2 2 10 10 E 3 3 F 4 4 G 5 5 45 45 H 6 6 46 46 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
(+ = kháng nguyên; N = đối chứng âm; P = đối chứng d−ơng) + Pha loãng huyết thanh cần chẩn đoán, huyết thanh đối chứng tỷ lệ1/100. Nhỏ vào các lỗ của đĩa phản ứng, mỗi lỗ 100 àl, ủ ở 37ºC trong 60 phút.
+ Gắn conjugate: Rửa đĩa phản ứng 3 lần bằng dung dịch rửa, tấm khô. Nhỏ vào mỗi lỗ 100 àl conjugate đã đ−ợc pha loãng tỷ lệ 1/200, ủ ở 37ºC trong 60 phút.
+ Gắn cơ chất: Rửa đĩa 3 lần, thấm khô, nhỏ vào mỗi lỗ 100 àl cơ chất, để ở nhiệt độ phòng 20 - 30 phút.
+ Dừng phản ứng: Cho 50 àl Stopping-Solution/giếng để nhiệt độ phòng
+ Đọc kết quả phản ứng bằng máy đọc ELISA với b−ớc sóng 405 nm. Đánh giá kết quả theo công thức:
ODsaple - ODneg Giá trị%(% OD) =
ODpos - ODneg
x 100
Trong đó ODsample = của mẫu xét nghiệm. ODpos = đối chứng (+).
ODneg = đối chứng (-). Mẫu d−ơng tính khi OD > 30%. Mẫu âm tính khi OD < 20%.
Mẫu nghi ngờ khi 20% < OD < 30%.
3.5.4. Ph−ơng pháp ELISA để đánh giá đáp ứng miễn dịch (Phát hiện kháng thể) kháng thể)
Nguyên liệu phản ứng:
- Kháng thể bẫy (trapping antibodies): chế huyết thanh thỏ kháng vi rút LMLM type O (chủng O1 Manisa) bằng cách tiêm bắp kháng nguyên tinh khiết 146S trộn với chất bổ trợ Freund. L−ợng tiêm 40 àg kháng nguyên 146S trong 1ml. Sau 28 ngày tiêm nhắc lại với l−ợng 20 àg kháng nguyên 146S. Sau 10 ngày lấy máu, chắt huyết thanh, và định l−ợng để chọn độ pha loãng tối −u dùng cho phản ứng.
lang kháng vi rút LMLM type O (chủng O1 Manisa) bằng cách tiêm bắp 20 àg kháng nguyên 146 S trộn với chất bổ trợ Freund. Sau 28 ngày lấy máu, chắt huyết thanh và chuẩn độ, tìm độ pha loãng tối −u. Gắn kháng huyết thanh chuột lang với huyết thanh bò sạch, không có miễn dịch (50% v/v).
- Kháng nguyên: vi rút LMLM chủng O1 Manisa đ−ợc nuôi cấy trên môi tr−ờng tế bào BHK-21. Khi có bệnh tích tế bào (CPE - Cytopathie Effect) hoàn toàn xảy ra, thu lấy dịch tế bào. Sau đó tinh khiết vi rút bằng cách ly tâm 2500 vòng/phút. Thu lấy n−ớc trong chứa vi rút. Vô hoạt vi rút bằng BEI (Binary ethyleneimine) 2% và bổ sung glycerine (20% v/v) bảo quản ở -20ºC.
- Conjugate: kháng huyết thanh thỏ (IgG - imuno globulin) kháng chuột lang đ−ợc cộng hợp với enzim Horseradish peroxidase. Conjugate đ−ợc block với huyết thanh bò sạch, không có miễn dịch (50% v/v).
- Substrate: oxy già (Hydrogen peroxide - H2O2).
- Chất phát màu (Chromogen): OPD - Ortho Phenylenediamine.
- Dung dịch đệm để gắn kháng huyết thanh thỏ kháng vi rút LMLM (coating buffer): dung dịch đệm Carbonate bicarbonate pH 9,5.
- Dung dịch đệm (buffer A) pha loãng huyết thanh và kháng nguyên (PBST): dung dịch đệm PBS 0,01M bổ sung 0,5% Tween 20 và phenol red 1%, pH 7,4 - 7,6.
- Dung dịch đệm (buffer B) block pha kháng huyết thanh chuột lang và conjugate: dung dịch PBST bổ sung 5% sữa tách bơ (skimmed milk).
- Dung dịch rửa: dung dịch đệm PBS 0,002 M, pH 7,4-7,6.
- Dung dịch đệm Citrate acetate 1 M, pH 5,6, để pha dung dịch phát màu. - Đĩa ELISA 96 lỗ, Nunc Maxisorp.
- Đĩa chữ U 96 lỗ polystyrene.
Tiến hành phản ứng LPB- ELISA
B−ớc 1: Gắn đĩa
Cho 50 àl kháng huyết thanh thỏ đã pha loãng vào mỗi lỗ trong đĩa ELISA. Đậy nắp ủ qua đêm hoặc ở 37ºC/1 giờ.
Sơ đồ phản ứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 B C++ C++ 1 1 C C+ C+ 1 1 D C+ C+ 1 1 E C- C- 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 F C- C- 2 2 10 10 G Ca Ca 2 2 10 10 H Ca Ca 2 2 10 10 B−ớc 2: trung hoà
- Trên đĩa nhựa chữ U 96 lỗ, pha loãng huyết thanh cần kiểm tra theo cơ số 2, bắt đầu từ độ pha loãng 1/16 và kết thúc ở độ pha loãng 1/128, 30 àl mỗi lỗ.
- Pha loãng kháng nguyên vi rút LMLM type O1 Manisa 1/70. Nhỏ 30
àl kháng nguyên đã pha loãng vào tất cả các lỗ. Nh− vậy huyết thanh kiểm tra lúc này có độ pha loãng là 1/32, 1/64, 1/128, 1/256. ủ đĩa nhựa ở 4ºC qua đêm. Trong mỗi đĩa đều có đối chứng d−ơng mạnh, d−ơng yếu, đối chứng âm tính và đối chứng kháng nguyên Ca (chỉ có kháng nguyên và PBST).
B−ớc 3: gắn mẫu vào đĩa phản ứng
Rửa đĩa phản ứng 3 lần bằng dung dịch rửa, thấm khô. Sau khi rửa đĩa chuyển 50 àl hỗn hợp huyết thanh/kháng nguyên từ đĩa chữ u sang đĩa ELISA theo vị trí t−ơng ứng. Lắc, ủ ở 37ºC trong 1 giờ.
B−ớc 4: gắn kháng thể phát hiện
Rửa đĩa phản ứng 3 lần, nhỏ vào mỗi lỗ của đĩa 50 àl kháng huyết thanh chuột lang kháng vi rút LMLM đã d−ợc pha loãng tỷ lệ1/100 bằng dung dịch PBST bổ sung sữa tách bơ. Lắc ủ ở nhiệt độ 37ºC trong 1 giờ.
B−ớc 5: gắn conjugate
Rửa đĩa phản ứng 3 lần, nhỏ vào mỗi lỗ của đĩa 50 àl conjugate đã pha loãng 1/200. Lắc, ủ ở nhiệt độ 37ºC trong 1 giờ.
B−ớc 6: cho cơ chất (Substrate/chromogen):
Rửa đĩa phản ứng 3 lần, nhỏ vào mỗi lỗ 50 àl dung dịch substrate/chromogen tỷ lệ 1/200 (dung dịch ODP trong citrate acetate bổ sung 0,5% H2O2). Để ở nhiệt độ phòng trong chỗ tối, thời gian từ 20 - 30 phút. B−ớc 7: dừng phản ứng
Cho vào mỗi lỗ 50 àl dung dịch H2SO4 1,25 M.
Đọc kết quả: sử dụng máy đọc ELISA ch−ơng trình Program number 1 ở b−ớc sóng 492 nm.
* Tính kết quả:
Từ kết quả đọc ở máy ta có OD (Optical Density - đậm độ quang học) của huyết thanh. Từ OD ta tính đ−ợc PI (Percentage Inhibition - phần trăm ức chế mẫu). Mẫu huyết thanh nào có PI ≥ 50 đ−ợc coi là d−ơng tính (có kháng thể kháng vi rút LMLM).
Có thể đọc và tính kết quả tự động từ máy tính bằng phần mềm EDI 2.2. Công thức PI đ−ợc tính nh− sau:
OD mẫu xét nghiệm PI = 100 -
3.5.5. Ph−ơng pháp ELISA để phát hiện kháng nguyên
Có nhiều ph−ơng pháp chẩn đoán bệnh LMLM, nh−ng ph−ơng pháp t−ơng đối thông dụng hiện nay, cho kết quả nhanh và chính xác là ph−ơng pháp ELISA gián tiếp phát hiện kháng nguyên vi rút LMLM (Nguyễn Đăng Khải, Nguyễn Thị Thu Hà, Phạm Thành Long, 2000) [11]. Theo quy định của phòng thí nghiệm chuẩn về LMLM của OIE/FAO, biện pháp thích hợp nhất để phát hiện kháng nguyên của vi rút LMLM và giám định các type của vi rút LMLM là ph−ơng pháp ELISA. Đây là phản ứng Sandwich gián tiếp trong đó sử dụng kháng huyết thanh của thỏ kháng lại từng type vi rút LMLM làm kháng thể bắt, kháng thể chuột lang kháng lại từng type của vi rút LMLM làm kháng thể nhận diện. Kháng thể phát hiện là huyết thanh của thỏ kháng chuột lang gắn enzyme.
Phản ứng này cũng có nguyên lý giống với phản ứng ELISA phát hiện kháng thể. Tuy nhiên trong phản ứng này không có b−ớc trung hoà, thay vào đó ta cho huyễn dịch bệnh phẩm nghi có vi rút vào.
Sơ đồ phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên ĐCKN(+) Bệnh phẩm 1 Bệnh phẩm 2 Bệnh phẩm 3 type 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B B L L O A C Asia1 A B C D A A N N K K O A C Asia1 E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Bệnh phẩm 4 Bệnh phâm 5 Bệnh phẩm 6
Khác với phản ứng phát hiện kháng thể, trên một đĩa ELISA sử dụng 4 loại kháng nguyên của 4 type O, A, C và Asia-1, để định type vi rút có trong mẫu bệnh phẩm.
Đánh giá kết quả, mẫu nào có OD > 0.1 đ−ợc coi là d−ơng tính (có vi rút LMLM).
Trên một đĩa ELISA định type vi rút có thể xét nghiệm đ−ợc 6 mẫu bệnh phẩm.
Đánh giá kết quả theo tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm tham chiếu LMLM OIE (World Reference Laboratory).
- Hiệu giá kháng thể < 1/32 đ−ợc coi là âm tính.
- Hiệu giá kháng thể từ 1/32 - 1/64 có kháng thể nh−ng không đạt hiệu