3. đối t−ợng, nội dung, nguyên liệu
3.5.2. Ph−ơng pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm
- Quy trình tiêm phòng vắc xin của trại:
- Với đàn nái và đực giống: tiêm 2 lần/năm vào các tháng t− và tháng m−ời. - Với đàn lợn con: Tiêm phòng lúc đạt 60 ngày tuổi.
- Liều l−ợng: 2ml/con/1lần. Tiêm bắp hoặc tiêm d−ới da.
Ph−ơng pháp lấy máu
- Với lợn choai lớn và nái dùng tròng mõm để cố định lợn vào thành chuồng. - Với lợn con và lợn choai đặt nằm ngửa cố định trên kệ.
- Vị trí lấy máu tốt nhất là lấy tĩnh mạch cổ, sau khi cố định gia súc, cắt lông, sát trùng chỗ tĩnh mạch cổ, chờ chất sát trùng khô thì lấy máu. Có thể dùng dây garo thắt vào 2/3 d−ới cổ để tĩnh mạch nổi rõ.
- Cách lấy máu: dùng ống chân không có kim hai đầu hoặc syringe để lấy máu tĩnh mạch cổ, l−ợng máu ít nhất từ 2 đến 5 ml. Sau khi lấy máu, để nghiêng ống nghiệm một góc 45º ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 2 giờ, sau đó chắt huyết thanh vào lọ thuỷ tinh hay lọ nhựa 2ml vô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong điều kiện lạnh.
Lấy huyết thanh
Các mẫu đều đ−ợc đánh dấu ghi nhãn với các chỉ tiêu: số thẻ nái, số xăm tai con; trạng thái sinh lý; tình trạng sức khoẻ; ngày lấy mẫu; ng−ời lấy mẫu.
Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm.
Mẫu máu đặt trong thùng nhôm kín, thùng nhôm đặt trong hộp xốp có đá lạnh. Bệnh phẩm đ−ợc chuyển về phòng xét nghiệm càng nhanh càng tốt.
Bệnh phẩm là dịch hầu, nếu ch−a tiến hành xét nghiệm có thể bảo quản ở nhiệt độ âm sâu (-20 đến -45ºC), với mẫu là huyết thanh bảo quản nhiệt độ 2 đến 4ºC nh−ng cần tiến hành xét nghiệm sớm nếu để lâu hiệu quả giảm.
3.5.3. Ph−ơng pháp ELISA – 3 ABC để phân biệt miễn dịch tự nhiên và miễn dịch bị động tự nhiên
3.5.3.1. Cơ sở khoa học
Khi vi rút LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc móng chẵn, quá trình nhân lên của vi rút sẽ diễn ra. Trong quá trình này, vi rút vừa tạo ra các thành phần để tái tạo các hạt vi rút mới (các virion), vừa tạo ra các thành phần không tham gia tạo thành các hạt virion mới mà chỉ đóng vai trò các men giúp cho quá trình nhân bản. Các thành phần kết hợp thành bản thân vi rút có tính kháng nguyên gọi là protein cấu trúc (structure protein). Các thành phần không tham gia kết hợp thành virion mới và có tính kháng nguyên gọi là protein không cấu trúc (non- structure protein) [30].
Trong các protein không cấu trúc của vi rút LMLM thì kháng nguyên 3ABC có tính kháng nguyên rất cao, nó kích thích cơ thể gia súc tạo ra kháng thể đặc hiệu với số l−ợng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bò bị nhiễm. Do đó việc phát hiện kháng thể đặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc đang bị nhiễm vi rút LMLM.
Hiện nay n−ớc ta đang sử dụng vắc xin LMLM nhập từ hãng Intervet (Hà Lan), Merial (Pháp) và Pfizer (Mỹ). Những loại vắc xin này là vô hoạt và đã loại bỏ những kháng nguyên không cấu trúc. Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt vi rút) chứ không có kháng thể kháng lại kháng nguyên không cấu trúc 3ABC. Do đó, dùng phản ứng ELISA sẽ phát hiện đ−ợc gia súc nhiễm vi rút LMLM, kể cả những con đã đ−ợc tiêm phòng.
3.5.3.2. Nguyên liệu
+ Đĩa ELISA đ−ợc phủ kháng nguyên 3ABC của vi rút LMLM, kháng nguyên có độ tinh khiết cao đ−ợc sản xuất bằng ph−ơng pháp tái tổ hợp.
+ CHEKIT - Anti-IgG-PO-Conjugate (conjugate).
+ CHEKIT - washing&dilution-solution (dung dịch rửa). + CHEKIT - chromogen (cơ chất).
+ Huyết thanh âm chuẩn. + Huyết thanh d−ơng chuẩn. + Huyết thanh lợn cần chẩn đoán.
3.5.3.3. Các b−ớc tiến hành Sơ đồ xét nghiệm + + + + + + + + + + + + A N N 7 7 B P P 8 8 C 1 1 9 9 D 2 2 10 10 E 3 3 F 4 4 G 5 5 45 45 H 6 6 46 46 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
(+ = kháng nguyên; N = đối chứng âm; P = đối chứng d−ơng) + Pha loãng huyết thanh cần chẩn đoán, huyết thanh đối chứng tỷ lệ1/100. Nhỏ vào các lỗ của đĩa phản ứng, mỗi lỗ 100 àl, ủ ở 37ºC trong 60 phút.
+ Gắn conjugate: Rửa đĩa phản ứng 3 lần bằng dung dịch rửa, tấm khô. Nhỏ vào mỗi lỗ 100 àl conjugate đã đ−ợc pha loãng tỷ lệ 1/200, ủ ở 37ºC trong 60 phút.
+ Gắn cơ chất: Rửa đĩa 3 lần, thấm khô, nhỏ vào mỗi lỗ 100 àl cơ chất, để ở nhiệt độ phòng 20 - 30 phút.
+ Dừng phản ứng: Cho 50 àl Stopping-Solution/giếng để nhiệt độ phòng
+ Đọc kết quả phản ứng bằng máy đọc ELISA với b−ớc sóng 405 nm. Đánh giá kết quả theo công thức:
ODsaple - ODneg Giá trị%(% OD) =
ODpos - ODneg
x 100
Trong đó ODsample = của mẫu xét nghiệm. ODpos = đối chứng (+).
ODneg = đối chứng (-). Mẫu d−ơng tính khi OD > 30%. Mẫu âm tính khi OD < 20%.
Mẫu nghi ngờ khi 20% < OD < 30%.