- Thời gian thực hiện: từ tháng 1 đến tháng 6 năm
3.3.2 Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.2.1. Ph−ơng pháp thu thập mẫu hạt lạc
Lấy mẫu hạt theo vùng sinh thái nghiên cứu, ở mỗi vùng sẽ chọn đại diện là tỉnh, huyện, xã có diện tích trồng lạc lớn.
+ Vùng Đồng bằng sông Hồng: thu mẫu ở 5 tỉnh thành gồm Hà Nội (huyện Gia Lâm, Đông Anh, Sóc Sơn), Hà Nam (huyện Kim Bảng, Phủ Lý, Thanh Liêm), Hà Tây ( huyện Phúc Thọ, Ba Vì), Bắc Ninh (huyện Từ Sơn, Gia Bình), H−ng Yên (Văn Lâm, Văn Giang, Khoái Châu).
+ Vùng Trung du Bắc Bộ: thu mẫu ở Vĩnh Phúc (huyện Yên Lạc) + Vùng Đông bắc: thu mẫu ở Bắc Giang (huyện Hiệp Hoà, Yên Dũng, Thị xã Bắc Giang).
+ Vùng Tây Bắc: thu mẫu ở Hoà Bình (huyện Kim Bôi, Lạc Thuỷ). + Vùng Bắc trung bộ: thu mẫu ở Nghệ An (huyện Diễn Châu, Nghi Lộc). Mỗi huyện thu mẫu ở 1- 3 xã đại diện, mỗi xã thu thập mẫu từ 3 - 5 nông hộ. Mẫu thu đ−ợc trộn theo xã, trộn tiếp theo huyện thành mẫu tổng hợp, lấy mẫu phân tích từ mẫu tổng hợp, mỗi mẫu phân tích là 500 g củ giống hoặc 300 g hạt giống.
3.3.2.2. Ph−ơng pháp nghiên cứu trong phòng
*Ph−ơng pháp giám định nấm bệnh trên hạt giống
Dựa theo tài liệu giám định bệnh hại hạt giống của Viện nghiên cứu bệnh hạt giống Đan Mạch (Mathus S.B. & Olga K., 1999[62]), kiểm tra nấm bệnh tồn tại trên hạt giống bằng ph−ơng pháp giấy thấm.
Mỗi mẫu giống kiểm tra 200 hạt, đặt hạt trên giấy đã thấm n−ớc và ủ ở 200C trong 7 ngày trong điều kiện 12 giờ sáng, 12 giờ tối xen kẽ. Kiểm tra d−ới kính hiển vi quang học và soi nổi để xác định loại nấm có mặt trên hạt. Nhận xét sự phát triển của tản nấm, xác định hình thái nấm gây bệnh và giám định bệnh.
Vỏ củ từ các mẫu củ giống sau khi đã tách hạt làm thí nghiệm, tiến hành kiểm tra nấm bệnh tồn tại trên vỏ củ bằng ph−ơng pháp giấy thấm. Mỗi mẫu giống kiểm tra 150 – 200 vỏ, 50 vỏ/lần nhắc lại.
*Ph−ơng pháp xác định nấm bệnh trên các bộ phận của hạt lạc
Hạt lạc lấy từ các mẫu giống có mức độ nhiễm nấm khác nhau, tiến hành tách theo ph−ơng pháp S. B. Mathur (1976)[61]: ngâm hạt giống trong n−ớc cất sau 6 - 12 giờ (ngâm riêng từng hạt), tách từng bộ phận của hạt gồm vỏ lụa, nội nhũ, phôi, nhúng từng bộ phận đã tách vào trong dung dịch natri hypochloride 1% sau đó đặt riêng theo từng hạt để kiểm tra nấm bệnh tồn tại trên chúng bằng ph−ơng pháp giấy thấm. Tiến hành tách 150 hạt/một mức nhiễm, 50 hạt/lần nhắc. Giống lựa chọn thực hiện thí nghiệm tách là giống 75/23.
*Ph−ơng pháp kiểm tra sức nảy mầm của hạt giống
Theo ph−ơng pháp của Hội kiểm nghiệm hạt giống quốc tế (ISTA, 2003) và tiêu chuẩn ngành kiểm nghiệm hạt giống.
Ph−ơng pháp giấy thấm TP (Top of paper ): đặt hạt đ−ợc kiểm tra sức nảy mầm lên trên lớp giấy thấm đã no n−ớc trong các dụng cụ Jacobsen (có thể thay thế dụng cụ Jacobsen bằng hộp nhựa, đĩa petri). Đậy nắp hộp hoặc cho vào túi nilon để giảm tối thiểu sự bay hơi n−ớc và để giữ ẩm cho giấy thấm. Đặt hộp trong tủ nảy mầm hoặc trong buồng nảy mầm ủ ở điều kiện nhiệt độ 20 – 250C, kiểm tra sức nảy mầm của mẫu hạt qua 2 lần đếm dựa vào số mầm bình th−ờng. Lần đếm thứ nhất sau 5 hoặc 7 ngày, đếm số mầm bình th−ờng, ghi số l−ợng vào bảng điều tra, bỏ đi những mầm bình th−ờng đã đếm và tiếp tục ủ toàn bộ số hạt, mầm còn lại. Lần đếm thứ hai đ−ợc thực hiện sau đặt hạt 10 hoặc 14 ngày, đếm số mầm bình th−ờng, mầm bất bình th−ờng, hạt cứng, hạt t−ơi, ghi số liệu vào bảng (dựa theo tiêu chuẩn đã qui định để xác định mầm bình th−ờng, mầm bất bình th−ờng, hạt thối, hạt t−ơi). Tính số mầm bình th−ờng cho cả 2 lần đếm để xác định tỉ lệ nảy mầm của hạt.
đủ ẩm và cũng tiến hành kiểm tra sức nảy mầm của hạt nh− ph−ơng pháp giấy thấm.
Tiến hành kiểm tra 400 hạt/mẫu, 50 hạt hoặc 100 hạt cho 1 lần nhắc lại tuỳ vào kích th−ớc của hạt.
*Ph−ơng pháp phân lập nấm
Ph−ơng pháp phân ly nấm gây bệnh đ−ợc thực hiện theo ph−ơng pháp của Kiraly. Z và ct, 1983 [9], Lester W. Burgess [10].
Nấm đ−ợc lấy từ trên hạt giống bị bệnh, nuôi cấy trên môi tr−ờng nhân tạo sau đó chọn những hộp petri không bị tạp, nấm mọc đều, thuần và chuyển sang cấy ở hộp petri có môi tr−ờng mới.
Theo dõi đặc điểm hình thái, kích th−ớc, màu sắc của tản nấm trên môi tr−ờng nhân tạo. Mỗi mẫu phân lập của mỗi vùng sinh thái đ−ợc cấy trên môi tr−ờng PGA trong hộp petri. Thời gian theo dõi là 1, 3, 5, 7 ngày sau cấy.
3.3.2.3. Ph−ơng pháp điều tra ngoài đồng ruộng
Điều tra bệnh héo rũ gốc mốc đen hại lạc tiến hành theo ph−ơng pháp của Viện Bảo vệ thực vật 1997[28].
Vùng điều tra: vùng đồng bằng sông Hồng, vùng trung du Bắc bộ, vùng Đông bắc, vùng Tây bắc, vùng Bắc trung bộ đại diện gồm các tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Nghệ An, Bắc Giang. Điều tra trên giống Trạm Xuyên. Trên mỗi ruộng điều tra theo ph−ơng pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 100 cây ngẫu nhiên qua các lần điều tra. Đếm số thân bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (TLB %).
Điều tra định kỳ theo giai đoạn sinh tr−ởng của cây lạc. Điều tra 4 kỳ: thời kỳ cây con (từ mọc cho đến 7- 8 lá thật), thời kỳ ra hoa, thời kỳ hình thành củ, thời kỳ quả vào chắc đến thu hoạch.
3.3.2.4. Ph−ơng pháp bố trí thí nghiệm và theo dõi diễn biến của bệnh trên một số giống lạc khảo nghiệm
Thí nghiệm đ−ợc bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCB), 3 lần nhắc lại, 10m2/ô, mật độ 35 cây/m2.
Các dòng, giống lạc thí nghiệm: 75/23, D40, L12, D35A., D43, S12, D50, L14.
Định kỳ theo dõi 7 ngày/1lần trên toàn bộ ô thí nghiệm. Theo dõi số cây héo, chết do nấm A. niger và tính TLB(%).
Năng suất thực thu: thu hoạch và tính năng suất quả khô theo từng công thức.
3.3.2.5. Thí nghiệm khảo sát ảnh h−ởng của thuốc hoá học đến sự phát triển của nấm A.niger trên môi tr−ờng nuôi cấy
Khảo sát ảnh h−ởng của một số thuốc hoá học đến sự phát triển nấm trên môi tr−ờng nuôi cấy PGA: thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại.
+ Công thức I: Đối chứng (n−ớc vô trùng)
+ Công thức II: Carbenzim 50WP nồng độ 0.15%. + Công thức III: Topsin70WP nồng độ 0.05%.
+ Công thức IV: DithaneM- 45 80WP nồng độ 0.3%.
Khi môi tr−ờng đã đ−ợc nấu, hấp khử trùng xong để khoảng 1– 2 phút cho nhiệt độ môi tr−ờng giảm xuống 500C ta tiến hành đổ thuốc vào, lắc đều lên sau đó đổ ra đĩa petri. Thuốc phải đ−ợc hoà vào một ít n−ớc lạnh tr−ớc khi đổ vào môi tr−ờng để tránh bị vón thuốc.
Dùng que đột đ−ờng kính 5 mm, đột nấm từ các đĩa A. niger nguồn cấy nên bề mặt đĩa môi tr−ờng, theo dõi sự phát triển và sự sinh bào tử của tản nấm trên môi tr−ờng 1, 3, 5, 7, 10 ngày sau cấy. Lựa chọn đ−ợc thuốc có khả năng ức chế hiệu quả và tốt nhất trong các thuốc đã khảo sát trên để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2.6. Ph−ơng pháp khảo sát hiệu quả của một số thuốc hoá học dùng xử lý nấm A. niger trên hạt giống lạc và ảnh h−ởng của chúng đến sức nảy mầm của hạt
Hạt giống thí nghiệm : giống 75/23 vụ xuân 2004.
Thí nghiệm gồm 5 công thức, mỗi công thức kiểm tra 400 hạt, 100 hạt cho 1 lần nhắc lại.
* Công thức 1: Đối chứng (không xử lý hạt giống).
* Công thức 2: Xử lý hạt giống bằng Thizam 50 WP liều l−ợng 5.0 g/kg hạt. * Công thức 3: Xử lý hạt giống bằng Carbenzim 50WP liều l−ợng 1.9 g/kg hạt.
* Công thức 4: Xử lý hạt giống bằng hỗn hợp 1/2Thizam 50WP + 1/2Carbenzim 50WP liều l−ợng 2.5 g + 0.95 g/kg.
* Công thức 5: Xử lý hạt giống bằng Rovral 50 WP liều l−ợng 2.5 g/kg hạt. Các công thức xử lý hạt theo kiểu bán thô. Cân thuốc dạng th−ơng phẩm theo liều l−ợng khuyến cáo, hạt lạc vừa bóc nhúng n−ớc cho −ớt đều sau đó trộn với l−ợng thuốc vừa cân có cho thêm một chút n−ớc (để thuốc thấm đều và không bị bay) ủ trong 30 phút, rửa sạch tr−ớc khi đem ra gieo.
Tiến hành kiểm tra sức nảy mầm ở các công thức này theo ph−ơng pháp giấy thấm của ISTA nh− đã nêu ở mục 2.3.2.2.
Tính tỉ lệ hạt bệnh (%), tỉ lệ hạt không nảy mầm (%), tỉ lệ hạt nảy mầm (%), tỉ lệ mầm bệnh (%) ở mỗi công thức.
Tính tỉ lệ hạt nhiễm nấm A. niger (%), tỉ lệ hạt không nảy mầm nhiễm nấm A. niger (%), tỉ lệ hạt nảy mầm nhiễm nấm A. niger (%) ở mỗi công thức.
3.3.2.7. Thí nghiệm khảo sát hoạt tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. với nấm A. niger trên môi tr−ờng PGA
Thí nghiệm thử hoạt tính đối kháng: tiến hành cấy đối xứng nấm Trichoderma spp. và A. niger trên bề mặt đĩa môi tr−ờng (tâm đột cách nhau 35mm), theo dõi tốc độ phát triển của 2 loài nấm và khả năng lấn át nhau của chúng ở 1, 2, 3, 4, 5 ngày sau cấy.
Thí nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại. Nguồn A. niger
phân lập từ hạt giống vùng đồng bằng sông Hồng.
* Công thức 1: Đối chứng (cấy A. niger thuần trên đĩa môi tr−ờng)
* Công thức 2: A. niger + Trichoderma viride
* Công thức 3: A. niger + Trichoderma hazianum
Tính hiệu quả ức chế của nấm đối kháng đối với nấm bệnh bằng công thức Abbot . * Một số công thức tính toán A TLB% = x 100 B Trong đó: A: tổng số hạt, cây, lá bị bệnh B: tổng số hạt, cây, lá điều tra ∑ ( a x b )
CSB% = x 100
NxT
Trong đó: a: tổng số lá, cây bị bệnh ở mỗi cấp b: chỉ số cấp bệnh t−ơng ứng
N: tổng số lá, cây điều tra
T: chỉ số cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp Hiệu lực của thuốc đ−ợc tính theo công thức Abbott
C - T
Hiệu lực thuốc (%) = x 100 C
Trong đó: C: tỷ lệ hạt bị bệnh, đ−ờng kính tản nấm ở công thức đối chứng T: tỷ lệ hạt bị bệnh, đ−ờng kính tản nấm ở công thức có xử lý