2.5.4.1. Chỉ thị hình thái
Việc sử dụng các ựặc ựiểm hình thái trong phân loại sinh vật ựược sử
dụng từ rất sớm. Những tắnh trạng hình thái ựược sử dụng như là một chỉ thị
di truyền là những tắnh trạng do một locus gen quy ựịnh và sự thể hiện của chúng không bị ảnh hưởng của nhân tố môi trường. Tuy nhiên, việc sử dụng các chỉ tiêu hình thái trong phân tắch ựa dạng di truyền cũng có những hạn chế
nhất ựịnh: số lượng các chỉ tiêu hình thái là có hạn, chúng bị ảnh hưởng bởi quá trình tương tác gen và các nhân tố môi trường, các chỉ tiêu hình thái chỉ
thể hiện ở những giai ựoạn nhất ựịnh của quá trình phát triển cá thể.
2.5.4.2. Chỉ thị hoá sinh
* Chỉ thị Protein: Mỗi gen trong ựoạn ADN cần tìm mã hoá cho một protein ựặc hiệu, hoạt ựộng của gen trong dòng tế bào ựó sẽ sinh ra một protein
ựặc trưng. Người ta sẽ sử dụng các mẫu dò là các protein kháng thể ựã ựánh dấu phóng xạựể phát hiện ra protein cần tìm. Từựó suy ra dòng tế bào nào ựã sản sinh ra protein có phản ứng với mẫu dò. Bởi vì, trình tự của nucleotid của gen ựã ựược dịch sang ngôn ngữ hoàn toàn chắnh xác ựó là protein.
* Chỉ thị Isozym: là các enzym cùng xúc tác một phản ứng trong tế bào nhưng do các locus khác nhau quy ựịnh. Enzym có bản chất là protein và là chất
ựa ựiện di nên trong dung dịch nó ở trạng thái phân cực. Dưới tác dụng của dòng
ựiện một chiều, các phân tử protein khác nhau về kắch thước, trọng lượng phân tử, lực tĩnh ựiện... sẽ chuyển ựộng với tốc ựộ khác nhau và sẽ phân bốở vị trắ khác nhau trên gen sau khi ựiện di.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ27
2.5.4.3. Chỉ thị phân tử ADN
Từ khi ra ựời kỹ thuật PCR, người ta ựã áp dụng thành công kỹ thuật PCR trong việc ựánh giá ựa hình ADN của sinh vật. đáng chú ý là các kỹ
thuật RAPD, AFLP, SSR, STS, RFLP. Trong các phương pháp thì hiện nay
ứng dụng nhiều hơn cả trên ựối tượng lily là RAPD. Các phương pháp này
ựều sử dụng kỹ thuật PCR làm nền nhưng khác nhau ở chỗ là sử dụng các mồi
ựược thiết kế khác nhau.
* Kỹ thuật RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADN) - đa hình các ựoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên.
Nguyên lý của phương pháp: Sử dụng một số mồi ngẫu nhiên nhất ựịnh (thường từ 10-40 mồi) ựể thực hiện phản ứng PCR, nhằm nhân các ựoạn ADN ựặc trưng của các mẫu nghiên cứu. Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu ựược gồm các ựoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kắch thước và cấu trúc. Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR nhân ựược các ựoạn khác biệt nhau. Mồi ngẫu nhiên là các ựoạn oligo nucleotid gồm khoảng 8-20 nucleotid, ựặc trưng cho mỗi loài sinh vật.
Ngày nay, kỹ thuật RAPD ựược ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu, phân tắch di truyền ở mức phân tử trên các loài cây trồng khác nói chung và ởLilium nói riêng.
* Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphims) - đa hình chiều dài các ựoạn ADN cắt bởi enzym giới hạn.
Kỹ thuật RFLP dựa trên ựặc ựiểm của các loại enzym giới hạn khác nhau, tạo nên các ựoạn cắt ADN khác nhau, tạo nên các ựoạn cắt ADN khác nhau phân biệt bằng ựiện di ựồ. Bản ựồ di truyền các kết quả RELP, có tắnh chắnh xác cao sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gen của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ28
nghiên cứu, xác ựịnh nguồn gốc hoặc kiểm tra mức ựộ tiến hoá của các loài sinh vật.
* Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - Sự ựa hình chiều dài của các ựoạn ADN ựược khuyếch ựại chọn lọc.
Kỹ thuật AFLP dựa trên cơ sở sử dụng PCR với các mồi ựặc hiệu ựể
khuyếch ựại một ựoạn ADN ựặc trưng của các mẫu nghiên cứu. Sau ựó thực hiện PCR lần thứ 2 với các mồi nối thêm 1 hoặc 2 nucleotid ở ựầu 3Ỗ(hoặc 5Ỗ) của mồi, ựể nhân các ựoạn ADN có tắnh ựặc hiệu cao. Kết quả PCR cho phép phân biệt mức ựộ giống và khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu ngay cả các mẫu so sánh có quan hệ di truyền gần nhau.
Sựựa hình thể hiện qua mỗi phản ứng khi sử dụng AFLP cao hơn nhiều so với RFLP và RAPD vì vậy AFLP có thể cho phép xem xét sự ựa hình ở
một số lượng lớn locus trong một thời gian ngắn và có thể sử dụng lượng nhỏ
ADN. AFLP ựang trở thành hệ thống chỉ thị lý tưởng cho hàng loạt các nghiên cứu di truyền và ựược sử dụng trong việc lập bản ựồ liên kết phân tử.
* Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Site) - điểm trình tựựược ựánh dấu Nguyên lý: dựa vào những locus ựã biết (gen, cADN,..) nhân trực tiếp bởi mồi PCR ựược thiết kế từ trình tự ựầu cuối của những locus ựặc trưng này. Kỹ thuật STS cho phép xác ựịnh những vị trắ cần biết bằng các trình tự
ADN biết trước.
* Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) - đa hình trình tự lặp lại
ựơn giản. Hệ gen sinh vật Eukaryote có mặt các trình tự nucleotid lặp lại, có kắch thước khác nhau ựặc trưng cho loài. SSR gồm 2-5 nucleotid lặp lại nhiều lần: (TG)n hoặc (AAT)n. Các ựoạn ADN nhắc lại này có trình tự 2 ựầu rất
ựặc trưng nên ựược sử dụng ựể thiết kế mồi cho PCR. Do có sự sai khác về
kắch thước của các ựoạn lặp lại nên kỹ thuật SSR rất thắch hợp cho nghiên cứu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ29
Kỹ thuật SSR ựơn giản, không tốn kém, là chỉ thịựồng trội nên ựược sử
dụng ựể phát hiện cá thể dị hợp tử.