Nam
Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho cây hoa lily nhằm tạo ra những cây con ựồng nhất về kiểu gen với số
lượng lớn mà các phương pháp nhân giống vô tắnh thông thường khác không thể có ựược. Có thể sử dụng nhiều bộ phận khác nhau của cây hoa lily ựể làm vật liệu khởi ựầu trong nuôi cấy in vitro như meristem, vảy củ, ựoạn thân...
Asjes và cộng sự (1974) [14] ựã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy meristem ựể tạo ra các giống hoa lily hoàn toàn sạch virus ở Hà Lan.
Tiếp theo ựó Van Aartrijk và Blom-Barnhoorn (1979) cũng ựã thành công trong việc sử dụng ựỉnh sinh trưởng ựể nuôi cấy. Ngoài ra nhiều bộ phận khác cũng ựược sử dụng ựể nuôi cấy như ựoạn thân (Sheridan,1968); nhị và cánh hoa (Takayama và Miawa, 1979) [14].
Sử dụng vẩy củ làm vật liệu khởi ựầu trong nuôi cấy ựã ựược nghiên cứu bởi nhiều tác giả Robb (1957), Hackett (1969), Allen (1974), Simmondds và Cumming (1976), Stimart và Ascher (1978), Van Aartrijk và Blom- Barnhoorn (1977)... Cho ựến nay thì vẩy củ là một nguồn nguyên liệu chủ yếu trong việc nuôi cấy mô khi sản xuất cây giống hoa lily do việc sử dụng vây củ
rất tiện lợi, dễ thành công và có hiệu quả cao hơn nhiều so với việc sử dụng các bộ phận khác của cây hoa lily ựể nuôi cấy [14].
Cùng với việc nghiên cứu khả năng cảm ứng từ vẩy củ của hoa lily thì nhiều tác giả trên thế giới ựã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một sốựiều
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ21
kiện và yếu tố môi trường trong việc nhân nhanh in vitro như mức ựộ gây tổn thương cho mô (Van Aartrijk và Blom-Barnhoorn, 1984), ựiều kiện nhiệt ựộ
ánh sáng (Niimi và Onozawa, 1979), thành phần môi trường dinh dưỡng (Slimart và Ascher,1978) [14].
Gautheret (1969) [14] quan sát thấy hàm lượng dinh dưỡng muối khoáng ựóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phân chia của mô hoa lily nuôi cấy.
Các tác giả Van Aartrijk và Blom-Barnhoorn (1984)[57] ựã tìm ra môi trường thắch hợp cho nuôi cấy hoa lily là môi trường MS có hàm lượng muối khoáng giảm ựi một nửa. Các ông cũng chứng minh rằng việc bổ sung nicotinic acid, pyridoxin HCl và glicin là không cần thiết ựối với việc nhân giống mô hoa lily, trong khi thiamin HCl và meso inositol lại ựóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy (Barz và Nicolas, 1978 [32]; Murashige, 1974 [45]).
đường saccaroze ựóng một vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy in vitro, ựiều này ựã ựược chứng minh bởi nhiều tác giả. Takayama và Misawa (1979) [5] ựã chứng minh ựược môi trường có bổ sung 15% ựường Saccaroze
ựã làm giảm sự hình thành chồi và sinh trưởng của nụ hoa lily trong nuôi cấy vẩy củ in vitro.
Van Aartrijk và Blom-Barnhoorn (1984) [57] cũng ựã tìm thấy hàm lượng ựường từ 3-4% làm tăng cả về hệ số nhân chồi cũng như trọng lượng của củ hoa lily trong nuôi cấy. Giảm hàm lượng ựường xuống dưới 3% ựã hạn chế các chỉ tiêu trên.
Torres - K (1985) [56] cho rằng nồng ựộựường saccaroze hoặc glucoze từ 40 - 60g/l là thắch hợp nhất cho sự hình thành chồi ựối với 2 giống
Saintpaulia và Agrostis.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ22
môi trường là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng ựến sự phát sinh cơ quan và sự nhân nhanh. Các nghiên cứu của Zaghmout-O, Lorres-K [63] trên giống
Lilium longiflorum Harson chỉ ra rằng Glucoze, xylose, maltoze, lactoze có tác dụng làm tăng trọng lượng tươi của củ cũng như kắch thắch sự sinh trưởng phát triển của mô sẹo. Ảnh hưởng của lactose, galactoze và fructoze tuy có kém hơn song vẫn cho kết quả tốt hơn nhiều so với ựối chứng không có
ựường.
Một yếu tố không thể thiếu và mang tắnh quyết ựịnh trong nhân nhanh in vitro phải kể ựến sự có mặt của các chất ựiều tiết sinh trưởng. Theo Murashige (1962) [47] thì quá trình phát sinh chồi phụ thuộc vào tỷ lệ
Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Việc sử dụng các chất ựiều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô, tế bào ngày càng ựược sử dụng bởi nhiều tác giả khác nhau và cho các kết quả tương tự như trên.
Van Aartrijk và Blom-Barnhoorn (1984) [57] ựã xác ựịnh ựược vai trò của α-NAA và BA trong nuôi cấy vẩy củ. Theo 2 ông thì α-NAA ựóng vai trò quyết ựịnh ựến sự tái sinh chồi, số chồi/vẩy và sự tăng trưởng của củ về trọng lượng khi dùng ở nồng ựộ thấp. Ở nồng ựộ cao, tác dụng của α-NAA hoàn toàn ngược lại. Trong nuôi cấy, BA hoàn toàn không ảnh hưởng ựến sự tái sinh chồi song lại thúc ựẩy quá trình sinh trưởng của các chồi tái sinh.
Nghiên cứu quá trình nhân củ hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường ựược bổ sung axit abscisic của Kyowa và Hakko (1986) [42] kết quả cho thấy rằng axitabcisic có thể ức chế quá trình tạo mô sẹo song lại kắch thắch quá trình hình thành củ con và làm mập chồi.
Maesato - K, Sarma - K, Fukui - H, Hara - T (1991) [48] khẳng ựịnh hàm lượng thấp của α - NAA và 2,4-D thắch hợp cho tạo rễ trong khi hàm lượng cao của α - NAA không chỉ kắch thắch tạo rễ nhiều mà còn thúc ựẩy sự
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ23 Ở Việt Nam nghiên cứu về nhân giống in vitro hoa lily cũng ựược tiến hành và ựã ựạt ựược một số thành tựu sau:
Mai Xuân Lương và cộng sự (1993) [12] ựã thăm dò quy trình nhân giống hoa loa kèn trắng (hoa huệ tây - Lilium longiflorum Hance) trên các môi trường ựa lượng với các mức dinh dưỡng khác nhau như: MS, White, B5, Knutson C, thậm chắ cả môi trường Knop nhưng tốt nhất là môi trường MS. Tất cả các môi trường ựa lượng trên ựều cần bổ sung các nguyên tố vi lượng, vitamin. điều kiện thắch hợp cho tái sinh và sinh trưởng là nhiệt ựộ 18-20oC, chếựộ chiếu sáng 2500-3000 lux, 16 giờ chiếu sáng mỗi ngày.
Dương Tấn Nhựt (1994)[13] ựã công bố kết quả nghiên cứu giống hoa huệ tây bằng phương pháp nuôi cấy vẩy củ, nhằm ựưa ra một giải pháp hữu hiệu khắc phục hiện tượng thoái hoá giống trầm trọng tại đà Lạt hiện nay. Vẩy củ ựược khử trùng bằng HgCl2 2% trong 5 phút, sau ựó cấy trên môi trường MS có bổ sung các thành phần Vitamin, chất hữu cơ và saccaroze. Sau khi tạo ựược cây con trong ống nghiệm, có thể tiếp tục nhân bằng tách các chồi ựược tạo thành ựem cấy trên môi trường nhân.
Dương Tấn Nhựt (1998) ựã công bố kết quả nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng của than hoạt tắnh tới sự phát triển bộ rễ của cây hoa loa kèn (Lilium longiflorum) ở nồng ựộ 1g/l trong nhân giống in vitro. Năm 2001 Dương Tấn Nhựt và cộng sự ựã công bố kết quả nghiên cứu cho thấy than hoạt tắnh có
ảnh hưởng tốt ựến tỉ lệ sống và sự phát sinh chồi của lát mỏng ựoạn thân
Lilium longiflorumở nồng ựộ 1g/l [27].
Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (1999) [15] cho biết có thể sử dụng hỗn hợp 0,2 mg/l α-NAA + 1 mg/l BA trong môi trường tái sinh mầm chồi từ vẩy củ hoa loa kèn trắng. Cũng trên môi trường này cho hệ số nhân là 4,4 lần (sau 4 tuần nuôi cấy) khi tiếp tục nhân nhanh các mầm chồi tạo ựược. Hàm lượng saccaroze thắch hợp cho quá trình tạo củ trong ống nghiệm là 4,5 % và ựặt
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ24
trong ựiều kiện bóng tối hoàn toàn.
Một số nghiên cứu tạo củ in vitro của giống hoa lily cũng ựã ựược nghiên cứu:
Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (1999) [16] cho biết nồng ựộ ựường saccaroze 5%là môi trường cho chất lượng củ giống cao và tạo ựiều kiện cho cây sinh trưởng phát triển tốt hơn.
Nguyễn Quang Thạch và Nguyễn Thị Nhẫn (2001) [17] ựã ựưa ra kỹ
thuật tạo củ in vitro trong công tác nhân giống hoa loa kèn.
Nghiên cứu khác của Nguyễn Thái Hà và cộng sự (2003) [30] công bố
kết quả nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro các giống hoa Lilium và kết luận
ựường saccaroze là thành phần quan trọng quyết ựịnh sự hình thành củ in vitro, hàm lượng ựường từ 9-12% cho hệ số nhân củ từ 1,8-4,1 lần tuỳ thuộc vào từng giống, môi trường bán lỏng 12% ựường có bổ sung 0,1 BA và 0,01
α-NAA trong ựiều kiện tối là tốt nhất cho quá trình tạo củ từ vẩy và tăng cường kắch thước củ.
Theo Nguyễn Thị Lý Anh và cộng sự (2005) [25] thì tuổi chồi trong
ống nghiệm cũng ảnh hưởng tới sự hình thành củ in vitro, các chồi 10 tuần tuổi có khối lượng củ trung bình tốt nhất, chồi 8 tuần tuổi cho hệ số nhân thấp hơn.
Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2006) [29] cho biết môi trường tốt nhất cho sự tái sinh chồi của callus có nguồn gốc từ mô vẩycủ của giống hoa loa kèn trắng Lilium formolongo là môi trường MS + 1 BA + 0,25 α-NAA + 30 saccaroze + 6,5 g/ agar (pH = 5,7).
Nghiên cứu của Cao Huyền Trang (2006) [21] cho biết khả năng tạo củ
nhỏ từ lát cắt vẩy củ phụ thuộc vào kắch thước và vị trắ lát cắt vẩy củ in vitro. Chiều dày lắt cắt 1,0-1,5 mm từ củ in vitro có ựường kắnh 4-5 mm cho hiệu quả tạo củ cao nhất. Lát cắt càng sát phần gốc củ thì càng cho tỷ lệ phát sinh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ25
củ cao.
Nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2006) [26] cho thấy kiểu gen ảnh hưởng rất nhiều lên khả năng tái sinh của các mẫu cấy, khả năng nhân chồi cũng như sụ phát triển của chồi. Hai giống lai Lily ỔTiberỖ và Lily ỔSorboneỖ có khả năng tái sinh từ thân non và vẩy củ rất cao.