M, dấu thang phân tử lượng; S, sản phẩm PCR được điện di trong gel agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và kích thích bằng UV.
1) Cắt DNA nhiễm sắc thể bằng một enzyme hạn chế (RE): Hai chiến lược cắt khác nhau, bên phải cắt đoạn DNA đã biết, bên trái không cắt DNA đã biết (phù
khác nhau, bên phải cắt đoạn DNA đã biết, bên trái không cắt DNA đã biết (phù hợp chỉ khi đoạn DNA đã biết tương đối ngắn); 2) Kết nối bằng ligase: bên phải sắp xếp lại, bên trái tạo vòng; 3) Bằng PCR tổng hợp đoạn DNA chưa biết bằng mồi "hướng ra ngoài" từ vùng DNA đã biết; 4) Đưa ngẫu nhiên sản phẩm PCR vào vector plasmid pGEMT (đầu bằng); 5) Clone hóa trong E. coli; 6) Kiểm tra các clone (khuẩn lạc trắng) có đoạn DNA đích bằng hai cặp mồi lộ xuất hai "trình tự ngữ cảnh (contextual sequences)" đặc hiệu; và kiểm tra điểm nối 7) Giải trình đoạn DNA chưa biết kề bên đoạn DNA đã biết.
1 2 3 4 5 6 7
Trong bước tiếp theo các sản phẩm cắt bằng RE được kết nối bằng enzyme phage T4 ligase (ở 16 ºC) rồi tái tổ hợp vào vector plasmid và biến nạp vào E. coli. Chọn những dòng (clone) biến nạp (khuẩn lạc trắng) và tìm clone chứa DNA mong muốn. Với bước này ta hoặc cần lai với hai mẫu dò đặc hiệu hai đầu mút đoạn DNA đã biết, hoặc bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu (hướng ra ngoài đã trở thành hướng vào trong) đã được thiết kế trước dựa trên trình tự đã biết để xác nhận có sản phẩm đích. Sau khi đã chọn được clone mong muốn ta có thể thực hiện kỹ thuật sequencing thông thường xác định trình tự nucleotide đoạn DNA đã dòng hóa.
Ngoài hai kỹ thuật trên đây ta còn có thể sử dụng một số chiến lược khác như thực hiện PCR với một mồi đặc hiệu được thiết kế trên cơ sở trình tự DNA đã biết và một primer ngẫu nhiên, hoặc là trình tự đặc hiệu transposon (gen nhảy) hoặc là một hexamer... Cuối cùng, tương tự các chiến lược trên, biện pháp tiếp theo là dòng hóa vào tế bào khả nạp và thực hiện sequencing.