X. Phân tích protein
3. Phương pháp thẩm Western (Western blot)
Sau khi điện di, protein được chuyển sang màng nylon hay nitrocellulose rồi thao tác kiểm xuất protein đặc hiệu bằng kháng thể. Tuy nhiên, phương pháp có thể biến đổi tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu và loại mẫu. Phổ biến nhất là dùng phương pháp kháng thể gián tiếp đánh dấu peroxidase (conjugate gián tiếp HRPO). Dưới đây trình bày phương pháp này. Những phương pháp sử dụng conjugate đánh dấu enzyme khác như phosphatase kiềm cũng tiến hành tương tự nhưng với cơ chất màu khác loại.
3.1. Blotting
1) Tháo gel khỏi thiết bị điện di. Ngâm gel vào dung dịch đệm chuyển mẫu
hai lần mỗi lần khoảng 5 phút để trung hòa.
Dung dịch đệm chuyển mẫu chứa Tris 25mM, glycine 192mM và methanol 20%.
2) Cắt màng (nylon, nitrocellulose) theo kích thước của gel, đặt gel và màng vào thiết bị chuyển mẫu sao cho có trình tự như sau: cực âm (cathode) - giấy thấm 3MM - gel - màng - 3MM - cực dương (anode). Ráp thiết bị và cho chạy trong 1 đêm ở 30 V hoặc 5 giờ ở 60 V. Khi cần, để nhiệt độ không tăng cao cần bố trí chuyển gel trong phòng lạnh.
Gần đây phương pháp chuyển mẫu từ gel sang màng được cải tiến.
Hình 12: Kết quả điện di protein toàn tế bào một số chủng vi khuẩn trong gel SDS-PAGE.
Bản gel được nhuộm bằng CBB R-250, kẹp giữa hai tấm cellophan và sấy khô có thể lưu giữ được lâu. Chú ý các làn ở biên thường biến dạng.
Thiết bị chuyển gel semi-dry tăng tốc độ chuyển mẫu rất nhiều. Thiết bị này cũng cấu tạo từ hai bản cực có diện tích lớn và tương đương nhau và thường lớn hơn gel, một tấm trên và một tấm dưới. Đặt lên tấm bản cực dưới (anode) một tấm 3MM, lại đặt lên đó một màng lọc có kích thước bằng bản gel, sau đó là bản gel rồi một tấm 3MM và cuối cùng đặt bản cực thứ hai (cathode) ép lên sao cho không khí không tồn tại ở khoảng giữa gel và màng. Bật điện để điện di nhờ độ ẩm từ gel thấm ra giấy trong khoảng 3 giờ dưới 60 V (nên thực hiện trong buồng lạnh).
3.2. Nhuộm bằng kháng thể
1) Blocking (phong bế) có tác dụng ngăn trở kháng thể thấm và cố định không đặc hiệu vào phần còn lại (chưa được gắn protein). Tháo màng khỏi thiết bị chuyển, ngâm màng vào dung dịch phong bế màng (membrane blocking solution) khoảng 20 ml/màng trong một ống chất dẻo hoặc túi chất dẻo trong khoảng 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Lắc đều, nhẹ nhàng.
Dung dịch phong bế màng gồm 10% huyết thanh bê, hoặc là 1% albumin huyết thanh bò và 3% gelatin, 1% sữa loại bơ (skim milk) pha trong PBS hoặc T10N50-NP40. Huyết thanh bê là dịch phong bế thường sử dụng nhất. Đương nhiên, nếu nghiên cứu protein huyết thanh thì không được sử dụng các thành phần của huyết thanh. Gelatin nếu gặp lạnh sẽ keo cứng lại nên cần nâng nhiệt độ lên trong quá trình ủ.
T10N50-NP40 chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, NaCl 50mM và nonident P-40 0,05%.
2) Kết hợp kháng thể: Pha loãng kháng thể (thường pha loãng 1.000 - 3.000 lần bằng dung dịch phong bế màng), cho màng vào túi chất dẻo, thêm vào đó 5 - 10 ml dung dịch kháng thể, ủ trong 1 - 3 giờ, lắc đảo nhẹ nhàng thường xuyên.
3) Ngâm mỗi màng trong 10 ml T10N50-NP40 ba lần liên tiếp mỗi lần 10 phút trên máy lắc. Cuối cùng rửa màng thêm 10 phút bằng dung dịch này lần nữa.
4) Kết hợp kháng thể thứ hai (conjugate): Pha loãng kháng thể gắn peroxidase trong dung dịch phong bế, ngâm màng tương tự như bước thứ hai nêu trên trong khoảng 1 giờ.
5) Rửa màng tương tự bước thứ ba nêu trên.
6) Phản ứng phát màu: pha sẵn 15 mg 4-chloro-1-naphtol trong 5 ml methanol và 15 µl H2O2 30% trong 25 ml T10N50-NP40. Trước khi sử dụng
pha hai dung dịch này để có dung dịch cơ chất màu của peroxidase. Ngâm màng trong dung dịch này trong 10 - 20 phút để phát màu. Để phát màu xong đem màng rửa nước và sấy khô. Kết quả phát màu phản ánh sự hiện diện của kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể dùng cho phản ứng tức là kháng nguyên protein đích.
Chú ý: Ngoài cơ chất màu trên đây với trường hợp kháng thể kết hợp peroxidase còn có thể sử dụng cơ chất màu 3,3'-diamino-benzidine tetrachloride (DAB) hoặc 3-amino-9-ethyl carbazole (AEC)... với màu phát ra khác biệt.
Bên cạnh kháng thể kết hợp peroxidase ta còn sử dụng kháng thể kết hợp phosphotase kiềm hoặc kháng thể kết hợp protein A, hay đánh dấu phóng xạ bằng nguyên tố 125I với những phương pháp kiểm tra riêng.