Trong các thí nghiệm DNA tái tổ hợp thường cần phải biết liều lượng DNA hoặc RNA tham gia phản ứng. Định lượng DNA và RNA có thể dựa vào nguyên lý hóa học và vật lý. Tuy nhiên trong các thí nghiệm công nghệ DNA thì có thể sử dụng nucleic acid đã được tinh chế vừa phải, nghiêm ngặt định lượng là không hoàn toàn cần thiết (sai mấy % không thành vấn đề) và yêu cầu phương pháp trắc định càng đơn giản và càng nhanh càng tốt. Dưới đây trình bày ba phương pháp định lượng nucleic acid thường áp dụng với mục đích nêu trên.
1. Phương pháp quang học
Đây là phương pháp lợi dụng tính hấp phụ tử ngoại của nucleic acid và là phương pháp định lượng nhanh DNA và RNA. Nucleic acid chứa các loại base (A, T, G, C, U) có độ hấp phụ cực đại bức xạ có bước sóng gần 260 nm. Các base khác nhau có bước sóng bức xạ hấp thụ cực đại cũng như hệ số hấp thụ quang khác nhau, thậm chí cùng loại base nhưng với pH khác nhau cũng có hệ số hấp thụ khác nhau. Tuy nhiên, bình quân phân tử DNA hai sợi có hệ số hấp thụ A260 = ~20 có nồng độ 1 mg/ml còn dung dịch có A260 = 1 có nồng độ 50 µg/ml, với RNA cũng như DNA một sợi thì A260 = ~33 có nồng độ 1 mg/ml còn dung dịch có A260 = 1 có nồng độ 40 µg/ml. Máy trắc định DNA/RNA có thể được kết nối máy in để ghi lại kết quả đo.
Với phương pháp này có thể định lượng chính xác DNA tinh chế, nhưng do các đường và protein cũng hấp thụ UV nên với DNA chiết xuất từ động vật cũng như từ vi khuẩn có thể xác định sai nồng độ. Ngoài ra, các hợp chất dùng tinh chế DNA (như phenol, mercaptoethanol, EDTA...) cũng hấp thụ UV nên cần chú ý khi định lượng DNA bằng phương pháp này. Đặc biệt phenol có độ hấp thụ UV cao và cũng tan trong nước nên sau khi chiết xuất DNA bằng phenol và kết tủa bằng ethanol rồi hòa tan trong nước thì khả năng phenol hấp thụ UV là rất cao. Vì vậy, chú ý xử lý chloroform sau xử lý phenol.
2. Phương pháp định lượng bằng điện di
Trong nhiều trường hợp trắc định DNA bằng UV vẫn để lại nỗi lo cho nhà nghiên cứu, khi đó cần điện di một lượng mẫu trong gel agarose hoặc gel polyacrylamide chứa ethidium bromide và quan sát băng DNA dưới UV. Nếu điện di đồng thời với DNA đã biết nồng độ được pha loãng
dần thì có thể xác định được nồng độ DNA cần nghiên cứu. Phương pháp này không chỉ giúp định lượng DNA hay RNA mà còn biết trong DNA có chứa nhiều RNA hay không cũng như các nucleic acid cần nghiên cứu có bị phân giải hay không, làm yên tâm trong quá trình nghiên cứu.
3. Phương pháp nhỏ giọt định lượng nucleic acid
Trong nhiều trường hợp việc định lượng nucleic acid được thực hiện bằng các phương pháp trên nhưng khi đó phải có nhiều DNA và phải cô đặc lại hoặc khả năng tạp nhiễm nuclease là rất cao. Trong trường hợp tinh chế poly(A)-RNA, lượng nucleic acid có được thường rất ít (dưới 1 µ g) nên thực hiện định lượng theo các phương pháp trên thường gặp nhiều trở ngại và hao tổn vật liệu. Khi đó có thể dùng phương pháp nhỏ giọt để định lượng nucleic acid. Với phương pháp này có thể nhận ra lượng nucleic acid khoảng 1 ng. Lấy các dung dịch chứa 0,1 - 5 ng nucleic acid có thêm 1 µg/ml ethidium bromide làm dung dịch nucleic acid chuẩn được nhỏ lên tờ giấy bóng mỏng (Saran wrap) đặt trên máy chiếu xạ UV thành nhiều điểm mỗi điểm 3 µl. Lại nhỏ 3 µl dung dịch nguyên liệu nghiên cứu có chứa ethidium bromide tương tự bên cạnh dãy nucleic acid chuẩn nêu trên. Bật đèn tử ngoại để đối chiếu nồng độ nucleic acid mẫu với nucleic acid chuẩn mà xác định nồng độ mẫu. Sau đó, có thể dùng pipet để hút thu hồi mẫu.
Chương 2
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG TÁI TỔ HỢP DNA