VII. Tạo dòng thuần DNA bộ gen
2. Vector plasmid và cosmid
Bên cạnh vector là phage còn có các vector là các plasmid và coplasmid. Plasmid là vector khá dễ sử dụng với enzyme hạn chế có đầu dính cũng như đầu bằng (như pGEMT và pGEMT easy vector) nhưng chỉ đưa được những đoạn DNA ngắn không thể vận dụng trong việc tạo thư viện genome.
Nếu tổ hợp và chế tác được thư viện của các đoạn DNA càng dài (từ tế bào động vật vào vector) thì có thể chế tác được thư viện genome với một số lượng clone tái tổ hợp cần sàng lọc càng ít và có thể sàng lọc được các gen lớn cũng như tập đoàn gen trong một lúc. Bằng in vitro packaging có thể đưa DNA vào E. coli chủ một cách có hiệu quả. Tuy vậy, mặc dù các đoạn DNA có thể đưa vào phage lambda có thể dài đến 50 kb nhưng khi đó sẽ mất đoạn khá dài cần thiết cho quá trình sinh sản của phage nên các đoạn DNA có thể di nạp bằng phage thường chỉ khoảng 20 kb. Khi đó nên vận dụng plasmid. Một mặt plasmid có ưu điểm dễ tuyển lựa những dòng tế bào đã chuyển thể (biến nạp) nhờ thuộc tính kháng thuốc kháng sinh của các tế bào mang chúng, nhưng mặt khác mặc dù độ dài của plasmid có thể phát triển trong vi khuẩn E. coli là không hạn chế nhưng hiệu suất di nạp DNA nhờ quá trình biến nạp tổ hợp DNA-plasmid thường không cao hơn so với in vitro packaging, đặc biệt việc di nạp plasmid có phân tử lượng lớn thường có hiệu suất rất thấp. Do đó, để có những thư viện với DNA dài cần đến những tổ hợp plasmid và phage.
Cosmid là một plasmid vector kết hợp những thuộc tính sở trường của plasmid và phage như có miền cos (cos site) của plasmid và có năng lực in vitro packaging của phage nên sau khi di nạp vào E. coli chủ thì phát triển như một plasmid, cho nên có thể clone hóa được những đoạn DNA dài đến 45 kb.
Nhờ tổ hợp được với đoạn DNA dài và đã có nhiều thành công, coplasmid sử dụng plasmid pTL 5 được mô tả dưới đây. Bên cạnh đó, trong trường hợp nếu chế coplasmid từ pJB 8 (là plasmid được sử dụng có hiệu quả trong nhiều trường hợp) thì thay thế enzyme hạn chế như Bst EII bằng Hind III, Pvu II bằng Sal I, Bgl II bằng Bam HI cũng như thay thế yếu tố tuyển lựa là tetracycline bằng ampicillin.
2.1. Điều chế vector
1) Điều chế khoảng 100 µg DNA pTL 5.
2) Lấy 50 µg DNA cắt bằng Bst EII và 50 µg còn lại bằng Pvu II, sau đó chiết xuất bằng phenol và kết tủa bằng ethanol.
3) Xử lý cả hai mẫu DNA đã cắt bằng CIP (calf intestinal phosphatase) hoặc BAP (bacterial alkaline phosphatase) để loại bỏ gốc phosphate ở đầu. 4) Chiết xuất bằng phenol-chloroform 2 lần rồi kết tủa bằng ethanol. 5) Phân cắt cả 2 mẫu DNA nêu trên bằng enzyme Bgl II.
6) Bằng điện di trong gel agarose 1% phân li và tinh chế các đoạn DNA
Bst EII-Bgl II dài 4,7 kb và đoạn DNA Pvu II- Bgl II dài 1,6 kb, hỗn hợp lại (vector DNA).
2.2. Điều chế đoạn cần gắn
Thực hiện cắt DNA bằng Sau 3A tương tự như nêu ở trên, li tâm chênh lệch mật độ đường để thu phân đoạn có độ dài khoảng 35 - 50 kb.
2.3. Ligation (kết nối)
1) Thêm 100 đơn vị T4 ligase vào hỗn hợp chứa 1 µg DNA di nạp, 1 µg DNA vector, 1 µl dung dịch đệm ligation 10× và cho đủ 10 µl nước cất.
Dung dịch đệm ligation (kết nối) 10× chứa Tris-HCl (pH 7,5) 500mM, MgCl2 100mM, DTT 100mM và ATP 10mM.
2) Thực hiện kết nối chỉ chứa DNA di nạp cũng như chỉ DNA vector làm đối chứng.
2.4. in vitro packaging
Thực hiện tương tự với phage vector.
2.5. Tải nạp
1) Nuôi cấy E. coli chủ chủng 490 A recA- trong 5 ml môi trường LB trong 1 đêm.
(Ký hiệu recA- cũng như recA (đối lập với recA+) sau tên chủng vi khuẩn chỉ rằng chủng vi khuẩn này mất khả năng quang hoạt hóa, tức là sau khi bị chiếu tia tử ngoại dù sau đó có được chiếu bức xạ khả kiến (ánh sáng nhìn thấy) thì vi khuẩn cũng không sửa sai được DNA, nên không thể sống sót).
3) Pha thêm 2,5 ml dung dịch MgSO4 10mM, trộn đều thành huyền dịch. 4) Thêm vào mỗi 100 µl vi khuẩn khoảng 50 µl DNA đã được lắp ráp in vitro.
5) Để ở nhiệt độ phòng 20 phút.
6) Thêm 1 ml môi trường LB, ủ ở 37 °C 45 phút.
2.6. Plating (trải đĩa)
1) Đặt tấm màng nitrocellulose (vô trùng, không chứa chất tẩy rửa) trên bề mặt đĩa môi trường thạch LB chứa 10 µg/ml tetracycline (thạch LB-tet), sao cho không còn bọt khí dưới màng.
2) Trải vi khuẩn đã di nạp lên màng (15.000 khuẩn lạc trên mỗi đĩa 150 mm).
3) Ủ ở 37 °C.
2.7. Cấy sao bản (replication plating)
1) Sau khi trải đĩa ủ khoảng 12 giờ bắt đầu thấy các khuẩn lạc trên mặt màng nitrocellulose. Ủ cho đến khi thấy khuẩn lạc nhỏ vừa đủ thấy thì dừng lại.
2) Lấy màng ra và đặt màng lên tấm giấy thấm (đã tiệt trùng) sao cho các khuẩn lạc nằm phía trên.
3) Lấy một màng mới đặt lên đĩa thạch LB-tet mới, chờ cho ẩm đều thì đặt tấm màng đã mang khuẩn lạc lên đó, sao cho mặt trên của hai màng áp sát nhau. Có thể in lên hai màng mới (hai bản sao).
4) Đặt giấy thấm lên rồi áp phẳng mặt màng cho bề mặt hai tấm màng áp sát nhau.
5) Đánh dấu vị trí của các màng lọc bằng cách đâm kim. Lấy màng trên (màng cũ) đặt lên đĩa LB-tet mới sao cho các khuẩn lạc ở mặt trên, ủ ở 37 ºC, sau khoảng 1 giờ sẽ thấy lại các khuẩn lạc trên màng cũ và khoảng 3 giờ trên màng bản sao.
2.8. Sàng lọc
1) Ủ đến khi thấy khuẩn lạc trên màng bản sao.
2) Lấy màng bản sao đặt (sao cho các khuẩn lạc bên trên) lần lượt lên các tờ giấy thấm đã thấm sẵn các dung dịch như sau: SDS 10% trong 10 phút, thấm ráo dịch bằng giấy thấm, NaOH 0,5M - NaCl 1,5M trong 3 phút, thấm ráo dịch bằng giấy thấm rồi đặt lên ammonium acetate 1M - NaOH
0,02M trong 3 phút rồi thấm ráo dịch tương tự trên.
3) Rửa màng trong dịch SSC 2×, có giấy ráp Kimwipe hỗ trợ sẽ rửa nhanh váng của khuẩn lạc.
4) Thực hiện lai (hybridization) với phương pháp đã định với mẫu dò DNA thích hợp với gen đích.
2.9. Bảo quản
Có thể bảo quản library ở −70 °C trên màng theo 2 cách.
1) Tải màng lọc gốc lên mặt thạch đĩa LB-tet chứa 5% glycerol, ủ 37 °C trong 1 giờ. Sau đó ép lên trên màng đó một màng lọc mới đã làm ẩm bằng glycerol 5%, dùng kim chọc lỗ đánh dấu rồi cho đĩa vào bì chất dẻo hàn kín và để ở −70 °C.
2) Tải màng lọc gốc lên mặt thạch đĩa LB-tet chứa 25% glycerol, cho đĩa vào bì chất dẻo hàn kín và để ở −70 °C.