III. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA
1.6. Sequencing DNA với máy luân nhiệt và DNA-Sequencer tự động Với kỹ thuật mới những bước cần thực hiện hầu như không thay
Với kỹ thuật mới những bước cần thực hiện hầu như không thay đổi nhiều là chế tác gel polyacrylamide-urea và xử lý nhiệt kết hợp dịch màu trộn formamide sản phẩm sau phản ứng tổng hợp nối dài mồi (PCR với một mồi) và tải mẫu vào bản gel. Với việc sử dụng hỗn hợp phản ứng đánh dấu điểm cuối (terminator ready reaction mix) để có dịch tải vào gel chỉ cần trộn trong một ống đánh dấu hỗn hợp dưới đây rồi thực hiện phản ứng tổng hợp DNA trên máy luân nhiệt và xử lý như nêu ở các bước tiếp theo.
- 9,0 µl Terminator Ready Reaction Mix, - 3 - 6 µl Template DNA,
- 3,2 pmol Primer và - nước cất q.s. 20 µl.
Trong đó, Template DNA có thể là ssDNA 0,1 µg hoặc dsDNA 0,3 - 0,5 µg, hay sản phẩm PCR (10 - 30 ng/µl) 3 - 6 µl.
1) Thực hiện phản ứng luân nhiệt (tương tự PCR, xem mục XV chương 3) như sau: 95 ºC trong 10 giây, hạ nhanh xuống 50 ºC và duy trì trong 5 giây, nâng nhiệt nhanh lên 60 ºC và duy trì trong 3 - 4 phút, lặp lại 25 chu kỳ luân nhiệt, cuối cùng duy trì mẫu ở 4 ºC cho đến khi lấy ra và kết tủa sản phẩm bằng ethanol.
2) Chuẩn bị một ống Eppendorf 1,5 ml và cho sẵn vào đó 2,0 µl sodium acetate 3M (pH 4,6) và 50 µl 95% ethanol.
3) Chuyển cả 20 µl sản phẩm phản ứng qua ống 1,5 ml, trộn đều và đặt trên băng (nước đá) 10 phút.
4) Quay li tâm 10 - 15 phút ở 13.000 v/ph, loại bỏ hết lớp ethanol (bằng
Hình 10: Nguyên lý phản ứng phương pháp dideoxy đọc trình tự nucleotide với hỗn hợp bốn ddNTP đánh dấu huỳnh quang khác nhau.
Các ddNTP gắn chất phát bức xạ cảm ứng khác nhau khi kích thích bởi UV: ddATP gắn chất huỳnh quang phát sáng lục, ddGTP gắn chất huỳnh quang phát sáng tím xanh, ddTTP gắn chất huỳnh quang phát sáng đỏ và ddCTP gắn chất huỳnh quang phát sáng xanh lam), các mảnh DNA mang đầu huỳnh quang sẽ được lần lượt ghi lại khi dịch chuyển (nhờ điện di) qua đầu đọc (bố trí ở khoảng cách cố định so với độ dài bản gel) của máy sequencer tự động và tín hiệu tương ứng được ghi lại trong file tương ứng trong computer.
pipet hoặc đổ bỏ cũng được), tráng nhẹ tủa bằng 250 µl ethanol 75% rồi loại bỏ hoàn toàn lớp ethanol (tránh quấy vào tủa không thể nhìn thấy), làm khô.
5) Sau khi chuẩn bị gel, kiểm tra kết nối máy điện di với máy vi tính, thiết định protocol và thư mục về mẫu rồi điện di tiền khởi để kiểm tra độ sạch của bản gel (chủ yếu là bề ngoài tấm thủy tinh vùng quỹ đạo của đầu dò đọc huỳnh quang, nếu chưa sạch phải lau lại bằng isopropyl alcohol). 6) Xử lý dịch màu trộn formamide (chuẩn bị trước dung dịch loading
Hình 11:Kết quả giải trình gen trên máy tự động.
Thông tin được ghi và lưu lại dưới dạng các băng DNA có màu huỳnh quang khác nhau, dưới dạng sóng và trình tự nucleotide.
buffer bằng cách trộn formamide khử ion và EDTE (pH 8,0) 25mM chứa với tỷ lệ formamide:EDTA-Blue dextran là 5:1). Cho vào ống chứa sản phẩm phản ứng sạch nêu trên 4 - 6 μl dịch màu formamide, trộn xoáy và li tâm tập trung.
7) Xử lý nhiệt (đưa vào nước sôi 1 phút rồi đưa nhanh về nước đá đang tan cho đến khi tải mẫu).
8) Tải vào gel polyacrylamide-urea đã ráp trong máy Sequencer tự động như trình bày ở trên. Thể tích mẫu cần tải thường là 4 - 6 μl. Kiểm tra chế độ đọc và lưu thông tin trên máy tính kết nối với máy Sequencer. Chú ý, trong nhiều trường hợp tải mẫu ở các giếng gel kế tiếp nhau có thể dẫn đến hiện tượng nhiễu thông tin do có sự giao thoa giữa các làn kề nhau, khi đó tải gel cách giếng làm giảm hiện tượng này. Nếu cần tải tất cả các giếng thì nên tải hai lần. Lần đầu tải dịch phản ứng vào các lỗ giếng cách khoảng, điện di 10 phút rồi tắt máy (mở nắp thì máy tự động dừng) và tải mẫu vào các giếng xen kẽ còn lại.
9) Cho máy chạy 10 giờ (qua đêm). Các thiết bị Sequencer tự động sẽ tự động dò đọc sự dịch chuyển của các đoạn DNA trong gel một cách định kỳ (một số lần trong 1 phút, tùy thiết kế) trên một lộ tuyến cắt ngang đường dịch chuyển của DNA và lưu giữ thông tin cho việc phân tích kết quả (cũng như biên tập (edit) kết quả) trên máy vi tính. Với cách kiểm tra thực thời này thì các mảnh DNA có khối lượng phân tử càng nhỏ thì càng phát hiện sớm và lần lượt đến phát hiện phân tử có khối lượng lớn hơn.