V. Hệ phiên mã in vitro
2. Phiên mã in vitro (run-off assay)
Dịch chiết xuất từ tế bào nêu trên chứa nhiều loại RNA thông tin có thể được phiên mã một cách chính xác nhờ một số hệ thống enzyme và promoter khác nhau. Đối với tế bào HeLa như đã dùng để chiết xuất dịch ba loại nêu trên, người ta có thể sử dụng promoter major late của chủng
Adenovirus 2 với pol II hoặc promoter của rDNA của người với pol I để thực hiện việc phiên mã in vitro. Các loại promoter khác nhau có những tính chất khác nhau nên nồng độ các muối cần phải thiết định trước khi thí nghiệm.
2.1. Sử dụng promoter của rDNA của người với pol I
1) Điều chế dịch hỗn hợp phản ứng bằng cách trộn các thành phần sau đây trong một ống nghiệm (đang để trong nước đá hoặc trên băng):
- 10 µl dịch chiết xuất (toàn tế bào, S 100 hoặc dịch nhân), - 2,5 µl dung dịch đệm phản ứng, - α-amanitin (1mg/ml) 2,5 µl, - 2,5 µl 10× NTPs, - 1,5 µl rDNA mạch thẳng (0,25 µg/µl), - 0,5 µl [α-32P]UTP (10 µCi/µl), - 5,5 µl nước cất.
Dung dịch đệm phản ứng chứa HEPES-KOH (pH 7,9) 100mM, KCl 500mM, MgCl2 50mM và DTT 5mM.
0,25 mM.
2) Ủ dịch trên ở 30 ºC trong 60 phút cho phản ứng xảy ra.
3) Thêm 200 µl dung dịch dừng phản ứng, chiết xuất bằng phenol- chloroform rồi bằng chloroform, sau đó thêm 200 µl ammonium citrate 4M và 1 ml ethanol để thực hiện kết tủa bằng ethanol, tráng tủa bằng ethanol, hong khô. Cuối cùng pha TE vào để hòa tan tủa và điện di một phần nhỏ kiểm tra kết quả hệ phiên mã.
Dung dịch dừng phản ứng chứa urea 7M, SDS 0,1%, Tris- HCl (pH 7,9) 10mM, EDTA 10mM và tRNA 100 µg/ml.
2.2. Sử dụng hệ pol II với promoter major late Ad 2
1) Pha dịch phản ứng như sau:
- 10 µl dịch chiết xuất (toàn tế bào, S-100 hoặc dịch nhân), - 2,5 µl dung dịch đệm phản ứng,
- 2,5 µl NTPs 10×,
- 1,5 µl DNA major late của Ad 2 mạch thẳng (0,25 µg/µl), - 5µl [α-32P]UTP (10 µCi/µl),
- 7,5 µl Nước cất.
DNA major late của Ad 2 mạch thẳng có promoter ở đoạn từ base −500 đến +700, ở base +700 có vị trí nhận biết của Sal I và cắt bằng
Sal I có thể được sản phẩm phiên mã khoảng trên 700 base.
2) Xử lý tương tự như các bước tiếp theo của mục 2.1. (ủ ở 30 ºC trong 60 phút cho phản ứng xảy ra).
3) Thêm 200 µl dung dịch dừng phản ứng (nêu trên), chiết xuất bằng phenol-chloroform, chloroform, kết tủa bằng ethanol, tráng bằng ethanol 70% rồi điện di kiểm tra sản phẩm.
2.3. Điện di trong gel agarose
1) Hòa tan sản phẩm thu được của hệ phiên mã pol II với promoter major late Ad 2 hoặc của hệ sử dụng promoter của rDNA của người với pol I nêu trên (2.1 và 2.2.) trong 5 µl dung dịch chứa 40 µM sodium phosphate (pH 7,0) và 2 mM EDTA. Thêm vào đó 15 µl dịch nhuộm màu pha glyoxal, trộn đều.
13,3 ml DMSO, 1 ml XC 1%, 1 ml BPB 1%. (40% là dịch có nồng độ glyoxal thương mại, tương đương nồng độ 6M).
2) Ủ ở 50 ºC trong 60 phút.
3) Điện di trong gel chế theo công thức sau (pha trong nước): agarose 2%, glycerol 5%, sodium phosphate (pH 7,0) 10mM và EDTA 0,5mM.
4) Sử dụng sodium phosphate 10mM (pH 7,0) và EDTA 0,5mM làm dịch tuần hoàn trong quá trình điện di, dịch tuần hoàn này được bơm bởi một bơm nhu động (peristalic pump) qua hai cực của bản điện di chống nóng cho gel.
5) Kết thúc điện di, hong khô bản gel rồi thực hiện tự ký phóng xạ.
Chú ý: ngoài gel agarose còn có thể sử dụng gel polyacrylamide- urea. Khi đó sản phẩm được pha thêm dịch nhuộm màu pha formamide 90% rồi điện di trong dung dịch đệm TBE.