assay)
Trong trường hợp cần phải trắc định hiệu quả phiên mã của gen đã được di nạp vào tế bào nhân thực (eukaryota) người ta thường sử dụng gen CAT (chloramphenicol acetyl transferase) như là một gen chỉ báo (reporter gene) và kỹ thuật này được gọi là CAT assay (trắc nghiệm CAT). Đây là trắc nghiệm đơn giản, dễ tái hiện và có độ nhạy cảm cao nên rất tiện lợi. Trong đa số trường hợp, 48 giờ sau khi đưa gen vào tế bào nhân thực người ta đã có thể đo đạc được hoạt tính enzyme của CAT trước khi gen tái tổ hợp vào nhiễm sắc thể.
1. Thí nghiệm chính: chuyển nạp gen vào tế bào eukaryota
Kỹ thuật chuyển nạp DNA vào tế bào nhân thực (eukaryota) bằng cách trộn cho kết tủa chung calcium phosphate với DNA và lợi dụng năng lực thực bào của tế bào là kỹ thuật phổ biến, ngoài ra còn có thể sử dụng một số phương pháp khác như micro-injection (tiêm vi thể), phương pháp sử dụng DEAE-dextran và phương pháp sốc điện. Dưới dây trình bày phương pháp kết tủa chung calcium phosphate với DNA là phương pháp đơn giản và được coi là có hiệu quả cao.
1) Trước ngày thực hiện chuyển nạp cần trải khoảng 0,5 - 2×106 tế bào đang ở giai đoạn phát triển theo cấp số nhân vào đĩa môi trrường 10 cm. Các loại tế bào HeLa, tế bào L khoảng 1×106, tế bào 3Y1 khoảng 2×106/ đĩa 10 cm là thích hợp.
2) Trước khi thêm DNA cần chuyển nạp (trong tổ hợp với vector plasmid) khoảng 1 giờ thì thay đổi môi trường mới.
3) Tạo kết tủa Ca3(PO4)2-DNA trên tế bào bằng cách: thêm 50 µl dung dịch CaCl2 2,5 M vào 0,5 ml nước chứa 10 - 20 µg DNA. Sau đó duy trì đảo trộn dịch DNA vừa nhỏ từng giọt dung dịch HBS 2× cho đến hết 2,5 ml. Khoảng ít phút sau khi bắt đầu nhỏ sẽ thấy kết tủa trắng.
Dung dịch HBS 2× chứa 8,18 g (280 mM) NaCl, 5,95 g (50 mM) HEPES, 0,2 g (2,8 mM) Na2HPO4, thêm nước cho đủ 500 ml. Điều chỉnh pH bằng NaOH 1 M (khoảng 6 ml) cho đến 7,1 ở nhiệt độ phòng, lọc khử trùng rồi bảo quản ở 4 °C nếu cần dùng ngay hoặc ở −20 °C nếu bảo quản lâu.
sulfonic acid, dung dịch có tác dụng đệm. 4) Để yên 10 phút, cho tế bào vào rồi ủ 4 giờ.
5) Gây sốc bằng glycerol: rửa tráng tế bào bằng khoảng 10 ml PBS(-), nghiêng đĩa Petri để đổ hết dịch rửa, sau đó cho vào tế bào (vẫn trong đĩa) 1,5 ml dung dịch 15% glycerol-HBS, để ở nhiệt độ phòng 0,5 - 3 phút, hút bỏ dung dịch glycerol-HBS, rửa thêm 2 lần nữa bằng dung dịch PBS(-) như trên, thêm môi trường và ủ 40 - 48 giờ ở 37 ºC.
Dung dịch 15% glycerol-HBS chứa 30 ml glycerol 50% (w/v), 50 ml HBS 2×, 20 ml nước cất, lọc khử trùng, bảo quản ở 4 ºC.
PBS(-)(phosphate buffered saline) chứa 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,2 g KH2PO4, 2,16 g Na2HPO4.7H2O, thêm nước cất cho đủ 1 lít, hấp cao áp tiệt trùng.
6) Sau khi nuôi cấy 40 - 48 giờ, rửa và tập trung tế bào để thực hiện CAT assay (nhằm kiểm tra có gen vector vào tế bào hay chưa).
2. CAT assay
1) Sau khi rửa tế bào bằng khoảng 10 ml PBS(-), chuyển tế bào vào ống, quay li tâm 2.000 v/ph trong 5 phút để tập trung tế bào.
2) Huyền dịch hóa tế bào bằng 100 µl Tris-HCl 0,25M pH 7,5.
3) Phá vỡ tế bào bằng hóa băng - giải băng 6 lần (cho vào tủ lạnh −70 °C 30 phút rồi ngâm trong nước ở 37 °C cho đến khi tan chảy hết), kết hợp xoáy trộn.
4) Quay li tâm 10.000 v/ph trong 10 phút để thu nước mặt.
5) Lấy một phần nhỏ để đo protein (có thể thu được khoảng 2 - 5 µg/µl từ 1 đĩa 10 cm).
6) Lấy một lượng để có khoảng 30 - 100 µg protein, thêm 25 µl Tris pH 7,5.
7) Hút lấy 25 µl nước mặt vào một ống Eppendorf 1,5 ml, thêm 50 µl (0,1 µCi) [14C]chloramphenicol 4mM (pha trong Tris 0,25M, hãng Sigma...). 8) Ủ 1 giờ ở 37 °C.
9) Thêm ethyl acetate 0,3 ml, lắc trộn mạnh, quay li tâm 10.000 v/ph trong 10 giây, thu lấy lớp ethyl acetate ở trên, chú ý tuyệt đối không được hút theo nước phía dưới.
10) Thêm 0,3 ml ethyl acetate lần nữa, chiết xuất rồi hòa lẫn hai đợt ethyl acetate đã thu được. Cho vào bình hút ẩm (deccicator) và hút bằng aspirator (máy hút thủy tĩnh) để làm khô. Chú ý không dùng máy hút chân không (vacuum pump) vì ethyl acetate sẽ nhanh chóng làm hỏng máy. Để loại bỏ ethyl acetate còn có thể bơm thổi khí nitơ vào ống.
11) Hòa tan lại trong 20 µl ethyl acetate, nhỏ giọt đốm (spot) cách nhau 1 cm trên gần một đầu (cách mép 2 - 3 cm) của một bản sắc ký lớp mỏng silica gel. Khi đó, dùng một ống mao quản 5 µl dùng một lần (disposable capilary) hoặc pipet tự động loại nhỏ, mỗi lần nhỏ khoảng 1 µl, lặp lại mấy lần để có một giọt đốm.
12) Sử dụng dung môi chloroform-methanol (95:5) trong chậu chuyên dụng cho sắc ký lớp mỏng, nhúng mép dưới của bản gel trong dung môi, triển khai sắc ký (khoảng 1 đêm) cho đến khi dung môi ngấm lên cách mép trên 0,5 - 1,0 cm. (Chú ý nhúng đủ sâu coi chừng dung môi sụt xuống trong quá trình sắc ký).
13) Làm khô gel, tự ký phóng xạ (autoradiography). Thường thấy trên film X-quang mỗi làn có 3 băng (đốm đen) của chloramphenicol, 1'-methyl chloramphenicol và 3'-methyl chloramphenicol.
14) Trong trường hợp cần thiết thì dùng kéo cắt bản sắc ký để thu lấy đốm (spot), đo cường độ phóng xạ bằng liquid scintillation counter để xác định tỷ lệ [14C]chloramphenicol đã methyl hóa (thành 1'-acetyl chloramphenicol di động trong gel kị thủy với chloroform-methanol nhanh hơn chloramphenicol, còn 3'-acetyl chloramphenicol di động nhanh nhất). Sự có mặt của hai sản phẩm chuyển hóa từ chloramphenicol chứng tỏ bộ gen mã hóa enzyme CAT nằm trên genome của vector đã hoạt động, và như vậy khả năng các gen trên DNA tái tổ hợp trong tế bào chủ (tế bào eukaryota) biểu hiện tính trạng là cao.
Chương 3
KỸ THUẬT PHÂN TÍCH XÁC NHẬN PHÂN TỬ