2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỂ TÁCH TẾ BÀO UNG THƯ 1 Các yếu tố cần được khảo sát
2.3.3. Quy trình tách tế bào bằng phương pháp cơ học.
(a)Chuyển mẫu được trữ trong eppendorf có chứa môi trường DMEM 10% FBS vào đĩa petri (đường kính10cm).
(b)Rửa mẫu bằng PBSA có kháng sinh Gentamycin – Ampotericin B từ 2 – 3 lần để làm sạch mẫu.
(c)Sử dụng kéo cong hoặc thẳng cắt mẫu mô ra thành từng mãnh nhỏ, tiếp tục cắt nhuyễn các mãnh mô.
(d)Thêm vào đĩa petri 1ml FBS, chuyển những mãnh mô vào bình roux. (e)Để yên trong vòng 24 giờ, để giúp cho sự bám tế bào được xảy ra. (f) Thêm vào 5ml môi trường DMEM, cho vào tủ ấm 37oC, 5% CO2. (g)Quan sát kết quả sau 24 giờ, 48 giờ, …
Tạ Ngọc Tuyết Minh
55
Hình 15: Mẫu sinh thiết được trữ trong eppendorf chứa 1ml môi trường DMEM có huyết thanhFBS 10%
Hình 16: Chuyển mẫu được trữ trong eppendorf có chứa môi trường DMEM 10% FBS vào đĩa petri
Hình 17: Sử dụng kéo cong hoặc thẳng cắt nhuyễn mẫu mô
.
Hình 18: Hút mẫu sau khi khuấy cho vào Hình 19: Chuyển những mãnh mô
ống ly tâm vào bình roux
Thêm vào đĩa petri 1ml FBS, chuyển những mãnh mô vào bình roux Khuấy từ ở nhiệt độ 37oC từ 15
– 60 phút, khảo sát mật độ tế bào theo thời gian
Tạ Ngọc Tuyết Minh
56
Hình 21: Cho bình roux vào tủ ấm 37oC, 5% CO2 Hình 20: Đem ly tâm 1000v/ 5 phút
Hình 22: Cho mẫu vào giếng nuôi đặt
trong tủ ấm 37oC, 5% CO2
2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phòng đếm NEUBAUER
- Rửa phòng đếm bằng nước cất - Sấy khô - Rửa lại phòng đếm bằng cồn 70oC - Sấy khô - Đặt lamelle lên phòng đếm - Đóng bớt chắn sáng
- Xác định thị trường phòng đếm dưới kính hiển vi quang học - Cho mẫu vào phòng đếm
- Xác định mật độ tế bào theo quy tắc đếm phía trên, bên phải của các ô trong phòng đếm
- Phòng đếm gồm 9 ô lớn - Mỗi ô lớn gồm 16 ô nhỏ
- Đếm số tế bào trong 5 ô lớn (Vùng 1,2,3,4,5)
- Mỗi ô lớn có thể tích: 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3 = 10-4 ml
Tạ Ngọc Tuyết Minh
57
Hình 23: Các vị trí xác định số tế bào trên phòng đếm
1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁCH TẾ BÀO UNG THƯ CỔ TỬ