Nhằm mục đích tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter, chúng tôi tiến hành gắn sản phẩm PCR đã nhân được ở giống bèo tấm L.aequinoctialis DB2 vào vector pCR2.1 sử dụng bộ hóa chất GeneJETTM
PCR Cloning Kit nhờ những đặc điểm ưu việt của vector pCR2.1.
Vecctor pCR2.1 chứa đầy đủ các thành phần cần thiết của một vector tách dòng để có thể tự sao chép trong tế bào chủ. Vector này có khả năng cho số lượng bản sao lớn trong tế bào (200 bản sao/ tế bào), có khả năng tải các đoạn gen tốt và ổn định trong tế bào chủ. Đồng thời nhờ có kích thước nhỏ mà nó dễ dàng được biến nạp vào tế bào. pCR2.1 chứa vùng trình tự đa điểm cắt, mang hai dấu chuẩn chọn lọc là gen kháng sinh ampicilin và kanamycin.
Vector pCR2.1 đã được thiết kế để nhân gen ngoại lai ở vùng MCS. Ở mỗi đầu 3’ của mỗi sợi được gắn thêm một nucleotide T. Nucleotide T này rất dễ dàng bắt cặp bổ sung với nucleotide A ở trên đầu 3’ của sản phẩm PCR khi sử dụng Taq
DNA polymerase. Khi đó, sản phẩm PCR và vector pCR2.1 có thể tự nối ghép với nhau một cách dễ dàng.
Một đặc điểm nữa trong cấu trúc của vector pCR2.1 là trong vùng MCS có chứa operon LacZα mã hóa cho enzym β-galactosidaza như một dấu hiệu chọn lọc trắng- xanh để biến nạp mang plasmid tái tổ hợp: trên môi trường có chứa cơ chất Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D(-)-galactopyranoside) và IPTG (isopropylthio--D-galactoside) các khuẩn lạc tái tổ hợp sẽ có mầu trắng do đoạn chèn làm bất hoạt enzyme này.
Để chuẩn bị ghép nối, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Wizardkit. Như đã biết, việc sử dụng Taq DNA polymerase trong PCR sẽ tạo ra khoảng 70 - 90% sản phẩm PCR có thêm một nucleotide A ở đầu 3’, do đó phản ứng ghép nối sản phẩm PCR được thực hiện như sau: 1 µl đệm phản ứng 10X; 5 µl sản phẩm PCR, 1 µl H2O, 1 µl vector pCR2.1 và 1 µl enzyme T4 DNA ligase.
Sản phẩm của phản ứng ghép nối sẽ được đem biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50g/ml), Xgal (50g/ml) và IPTG (50g/ml) ở 370C qua đêm. Kết
quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc trắng là các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự mang đoạn DNA cần tách dòng (vùng promoter) hay không chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra.
3.3.2.3. Tách chiết plasmid DNA
Kết quả trên hình 3.9 cho thấy ở giống bèo tấm L. aequinoctialis DB1 có các dòng từ 1, 3, 4, 10, 11, 13, 14,15, 16 cao hơn dòng đối chứng, như vậy có thể kết luận sơ bộ là các dòng này đã được chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai.
ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Hình 3.9. Điện di plasmid trên gel agarose 0,8%
ĐC: DNA plasmid đối chứng
1-16: DNA plasmid mang gen giống bèo tấm L. aequinoctialis DB1
3.3.3. Xác định đoạn điều khiển gen bằng RE
Để kiểm tra kích thước thực tế của đoạn DNA được nối vào vector, chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu DNA plasmid pCRLaUbipin bằng phương pháp xử lý với enzyme giới hạn EcoRI để kiểm tra kích thước đoạn gắn. Các plasmid pCRLaUbipin số 10, 11, 31 thu được 2 băng 3,9 kb và 2,1 kb tương ứng với kích thước của vector pCR2.1 (3,9 kb) và của sản phẩm PCR – LaUbipin (hình 3.10 A) và được chọn để khảo sát tiếp theo. Các dòng này được xử lý tiếp bằng các enzyme hạn chế Sall vì trong trình tự của đoạn promoter có 1 điểm nhận biết của enzyme hạn chế này. Các dòng pCR2.1 LaUbipin thu được băng 5,9 kb (hình 3.10B). Cũng tương tự đối với các dòng pCRLaUbip, sau khi xử lý với enzyme EcoRI chúng tôi chọn được dòng pCRLaUbip số 1 có hai băng 3,9 kb và 1 kb tương ứng với kích
thước của vector pCR2.1 và sản phẩm PCR LaUbip. Dòng pCRLaUbip kiểm tra bằng SalI cho một băng 4,9 kb (hình 3.10 C).
Như vậy, kết quả kiểm tra các vị trí của enzyme cắt hạn chế có thể dự đoán về đoạn gắn chính là đoạn chúng tôi cần tìm.
Hình 3.10. Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme
M. Thang DNA chuẩn 1kb Đ/C. Plasmid đối chứng
A. Plasmid 10, 11, 31 pCRLaUbipin cắt bằng EcoRI. B. Plasmid 10, 11, 31 pCRLaUbipin cắt bằng SalI. C. Plasmid pCRLaUbip cắt bằng EcoRI và Sall.
3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter
Chúng tôi đã xác định trình tự DNA mẫu các plasmid số 10, 11 pCRLaUbipin và mẫu plasmid số 1 pCRLaUbip trên máy xác định trình tự tự động dựa trên cơ sở phương pháp của Sanger. Sau đó số liệu được xử lý bằng các phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection v2.0, DNA Sequencing Analysis v5.2, Seqscape v2.5, BioEdit v7.0.5, đã nhận đoạn promoter và 5’UTR có chiều dài là 964 bp ở giống bèo tấm L. aequinoctialis DB1. Sau đó chúng tôi đã tiến hành so sánh các trình tự này với trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài này ở Mỹ đã được công bố trên GenBank. Kết quả so sánh đoạn LaUbipin mẫu số 10 với trình tự trên GenBank được trình bày trên hình 3.10. Từ kết quả cho thấy ở đoạn này có 2 vị trí thay đổi so với loài này của Mỹ được thống kê ở bảng 3.2