3.3.2.1. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR
Chúng tôi tiến hành PCR nhân đoạn điều khiển bao gồm cả promoter và intron từ DNA tổng số của mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 sử dụng cặp mồi La-UbipF và La-UbipinR cho đoạn khoảng 2,1 kb (LaUbipin). Sản phẩm PCR này được sử dụng để tiến hành PCR nhân đoạn promoter với cặp mồi La-UbipF và La- UbipR với đoạn khoảng 1 kb (LaUbip).
Kỹ thuật PCR được tiến hành trong môi trường đệm thích hợp với hoạt động xúc tác của enzyme về pH, lực ion,… Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy theo loại enzyme sử dụng trong kỹ thuật PCR. Dung dịch đệm sử dụng cho enzyme Dream Taq DNA polymerase gồm có: Tris-HCl 100 mM; pH 8,3; KCl 500 mM; MgCl2 25 mM; gelatin 0,01%.
Chúng tôi tiến hành nhân đoạn promoter với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính như sau:
- Giai đoạn biến tính: lựa chọn 950C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ thích hợp để tách hoàn toàn DNA sợi kép thành 2 sợi đơn đồng thời vẫn đảm bảo hoạt tính của Taq DNA polymerase.
- Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ gắn primer tối ưu của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 cao hơn so loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2: 550C trong thời
ATG La-UbipF Promoter La-UbipR Intron La-UbipinR Sall-858 964 2068
gian một phút. Thông thường nhiệt độ gắn mồi sử dụng Taq DNA polymerase cao hơn so vói sử dụng Pfu DNA polymerase.
- Giai đoạn kéo dài chuỗi: đặt nhiệt độ ở 720
C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ làm việc tối ưu của Taq DNA polymerase và thời gian thì đủ để kéo dài chuỗi DNA kích thước khoảng 2 kb.
Ngoài ra, khi bắt đầu phản ứng chúng tôi đã cho chạy trước bước khởi động nóng ở 950C trong 4 phút để đảm bảo biến tính hoàn toàn DNA tổng số. Sau khi kết thúc 32 chu kỳ, chúng tôi đã đặt nhiệt độ 720C trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp DNA được kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở nhiệt độ 40
C. Sản phẩm PCR sau đó đã được kiểm tra trên gel agarose.
1 M 2
Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
M: Thang DNA chuẩn 1 kb
1: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 với cặp mồi La-UbipF và La-UbipinR
2: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 với cặp mồi La-UbipF và La-UbipR
Kết quả trên hình 3.8 cho thấy sản phẩm PCR của mẫu bèo tấm rất đặc hiệu. Căn cứ vào thang DNA chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR là 2,1 kb cho đoạn promoter và intron còn 1 kb cho đoạn promoter đúng với dự đoán của gen cần nhân. Sản phẩm PCR này hoàn toàn đạt yêu cầu làm nguyên liệu cho thí nghiệm tách dòng gen tiếp theo.
2 kb