3.2.2.1. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR
Chúng tôi PCR nhân đoạn promoter từ DNA tổng số của mẫu bèo tấm
S. polyrrhiza DB2 sử dụng cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipinR cho đoạn khoảng 2 kb (SpUbipin). Sản phẩm PCR này được sử dụng để tiến hành PCR nhân đoạn promoter với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipR với đoạn khoảng 1kb (SpUbip).
Kỹ thuật PCR được tiến hành trong môi trường đệm thích hợp với hoạt động xúc tác của enzyme về pH, lực ion,… Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy theo loại enzyme sử dụng trong kỹ thuật PCR. Dung dịch đệm sử dụng cho enzyme Pfu DNA polymerase gồm có: Tris-HCl 100 mM pH 8,3; KCl 500 mM; MgCl2 25 mM; gelatin 0,01%.
Một yếu tố quan trọng trong thành phần của đệm là ion Mg2+, khi tạo thành phức với dNTP, Mg2+
có tác dụng gắn dNTP với enzyme, kích hoạt DNA polymerase, tăng sự kết hợp giữa mồi và đoạn khuôn, cũng như tác động vào sự nóng chảy của DNA mạch kép. Nồng độ ion Mg2+
thay đổi tùy thuộc vào quá trình nhân bản những đoạn DNA cụ thể. Nồng độ các dNTP phụ thuộc nhiều vào kích thước đoạn DNA cần nhân, nồng độ ion Mg2+
và nồng độ đoạn mồi. Việc bổ sung ATG
Sp-UbipF Promoter
Sp-UbipR
Intron
Sp-UbipinR
PstI-474 HincII-934
1033
2013
các dNTP sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy. Một thành phần quan trọng khác của PCR là các đoạn mồi. Việc điều chỉnh nồng độ mồi có liên quan đến chất lượng sản phẩm thu được. Khi nồng độ mồi cao, mồi sẽ gắn không đặc hiệu trên khuôn DNA và cho ra sản phẩm gồm nhiều đoạn có kích thước không mong muốn. Ngược lại, nồng độ mồi thấp làm giảm hiệu suất phản ứng.
Đối với kỹ thuật PCR, việc thiết lập một chu trình phù hợp là yếu tố quan trọng, bởi vì yếu tố nhiệt đảm bảo cho sự giãn xoắn của phân tử DNA cũng như việc gắn đoạn mồi và kéo dài chuỗi. Chúng tôi tiến hành nhân đoạn promoter với 25 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính như sau:
- Giai đoạn biến tính: lựa chọn 950
C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ thích hợp để tách hoàn toàn DNA sợi kép thành 2 sợi đơn đồng thời vẫn đảm bảo hoạt tính củaPfuDNA polymerase.
- Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ gắn mồi phải thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer để các primer có thể bắt cặp với DNA khuôn. Đồng thời nhiệt độ gắn mồi cũng không được quá thấp khiến cho khuôn bị biến tính. Giá trị của nó phụ thuộc vào từng loại mồi và thấp hơn Tm từ 2 - 100C, trong đó Tm được tính theo công thức: Tm = 20
C x (A + T) + 40C x (G + C) + 3,30C. Sau khi tính được nhiệt độ nóng chảy theo lý thuyết, chúng tôi đã tiến hành PCR thử nghiệm với các nhiệt độ khác nhau và đã chọn được nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 500C trong thời gian một phút.
- Giai đoạn kéo dài chuỗi: đặt nhiệt độ ở 720C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ làm việc tối ưu của Pfu DNA polymerase và thời gian thì đủ để kéo dài chuỗi DNA kích thước khoảng 2 kb.
Ngoài ra, khi bắt đầu phản ứng chúng tôi đã cho chạy trước bước khởi động nóng ở 950C trong 4 phút để đảm bảo biến tính hoàn toàn DNA tổng số. Sau khi kết thúc 25 chu kỳ, chúng tôi đã đặt nhiệt độ 720C trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp DNA được kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở nhiệt độ 40
C.
Sản phẩm PCR sau đó đã được kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả trên hình 3.3 cho thấy sản phẩm PCR của mẫu bèo tấm rất đặc hiệu.
1 2 M
Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%
M: Thang DNA chuẩn 1 kb
1: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipinR
2: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipR
Căn cứ vào thang DNA chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR là 2 kb đối với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipinR và 1 kb đối với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipR, đúng với dự đoán của gen cần nhân. Sản phẩm PCR này hoàn toàn đạt yêu cầu làm nguyên liệu cho thí nghiệm tách dòng gen tiếp theo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});