Để tách chiết DNA plasmid, chúng tôi lấy 15 - 40 khuẩn lạc nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 370
C từ 12 - 14 giờ.
Trước tiên, các tế bào trong dịch nuôi cấy được thu nhận bằng cách ly tâm thu tủa. Tiếp đó chúng được xử lý bằng dung dịch I (có tác dụng rửa sạch tế bào); rồi bằng dung dịch II có chứa NaOH 0,2M và SDS 1%. Các cấu trúc của tế bào cũng như các liên kết hydro trong phân tử bị phá vỡ. SDS cùng với EDTA trong dung dịch II có vai trò ức chế các nuclease do EDTA liên kết các ion Mg2+
(yếu tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease), vì vậy ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết. Tế bào vi khuẩn E. coli có chứa hai dạng DNA: DNA nhiễm sắc thể của E. coli và DNA plasmid nên việc tách riêng, làm sạch DNA plasmid là rất quan trọng. DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dung dịch I, II, III. DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn lại liên kết chặt chẽ với protein trong phức chất nucleoprotein nên khoảng thời gian ngắn không kịp thoát ra ngoài. Trong khi đó, các phân tử DNA plasmid mạch vòng đã được giải phóng ra môi trường. Khi môi trường được xử lý tiếp với dung dịch III thì pH môi trường trở về khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng điện của DNA. Vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và được kiểm tra kích
thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose (hình 3.4)
ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Hình 3.4. Điện di plasmid trên gel agarose
ĐC: DNA plasmid đối chứng
1-15: DNA plasmid mang gen giống bèo tấm S. polyrrhiza DB2 Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ có kích thước lớn hơn plasmid đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA). Do vậy, độ cao thấp của các băng so với băng đối chứng là cơ sở để dự đoán dòng nào đã được chèn
thêm đoạn DNA ngoại lai. Kết quả trên hình 3.4 cho thấy ở giống bèo tấm
S. polyrrhiza DB2 có các dòng đều cao hơn dòng đối chứng, như vậy có thể kết luận sơ bộ là các dòng này đã được chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai.