Nhằm mục đích tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter, chúng tôi tiến hành gắn sản phẩm PCR đã nhân được ở giống bèo tấm S. polyrrhiza DB2 vào vector pJET2.1 sử dụng bộ hóa chất GeneJETTM
PCR Cloning Kit. Ưu điểm của việc sử dụng Kit này là thao tác đơn giản, tiện lợi, nhanh và hiệu quả.
Vector pJET1.2 có chứa điểm khởi đầu sao chép rep (pMB1) nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E. coli. Gen kháng Amp có trên vector cho phép chọn lọc những tế bào có mang vector này trên môi trường có Amp. Ngoài ra, vector này còn chứa gen eco471IR mã hóa cho nuclease phân hủy DNA nhân gây chết tế bào vật chủ. Khi vector được gắn thêm đoạn DNA ngoại lai thì gen eco471IR bị bất hoạt. Nhờ đó, quá trình lựa chọn dòng khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn. Trên vùng đa gắn MCS có chứa điểm nhận biết của các enzyme giới hạn như KpnI, XhoI, XbaI,… kế tiếp nhau giúp dễ dàng thao
2 kb 1 kb
tác lắp ghép, thu lại và kiểm tra đoạn DNA được chèn vào. Cuối cùng, hai trình tự mồi pJET1.2 xuôi và pJET1.2 ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định trình tự gen.
Trước khi thực hiện phản ứng ghép nối, chúng tôi tinh sạch sản phẩm PCR bằng Wizardkit. Thành phần phản ứng ghép nối như sau: 10 µl đệm phản ứng 2X, 5 µl sản phẩm PCR, 3 µl H2O, 1 µl vector pJET1.2 và 1 µl enzyme T4 DNA ligase.
Sản phẩm của phản ứng ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli
DH5α. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 370
C qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc là các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự mang đoạn DNA cần tách dòng (vùng promoter) hay không chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra.