* Nguyên tắc
Thành tế bào thực vật được phá vỡ bằng các biện pháp cơ học kết hợp với việc sử dụng các chất tẩy rửa mạnh. DNA được giải phóng và làm sạch tạp chất nhờ dung dịch phenol - chloroform - isoamyl (25 : 24 : l). DNA được kết tủa trong cồn tuyệt đối ở -200C và thu tủa nhờ ly tâm.
* Phương pháp tách chiết DNA tổng số:
Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng CTAB và PVP theo Stewart và Vie (1993) [56]. Bèo tấm nghiền trong nitơ lỏng. Khoảng 1 g mẫu thực vật được chiết trong 5 ml dung dịch đệm có chứa Tris-HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 10 mM; 0,1% β-mercaptoethanol, 2% CTAB, 1% PVP và 5 mM ascorbic acid, ủ ở 65oC trong ít nhất 1 giờ. Mẫu được sử lý bằng phenol-chloroform và cuối cùng bằng chloroform. Lớp trên cùng tách ra tủa bằng một phần mười thể tích Na-acetate 3 M và ba thể tích cồn ở -200C trong 2 giờ. Sau đó rửa lại 2 lần bằng cồn 70%. Cặn thu được làm khô ở điều kiện chân không và hòa vào 300 µl TE. Loại RNA bằng RNase.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng SDS và PVP theo Angelaes và cộng sự (2005) [10], có sự thay đổi trong thành phần dung dịch đệm chiết như sau: NaCl 2 M; Tris-HCl (pH= 8) 0,2 M; EDTA (pH=8) 70 µM; β-mercaptoethanol 0,2 M; PVP 100 mg/2ml dung dịch đệm chiết. Sau đó, cho thêm 0,2 ml 20% SDS đối với 1 g mẫu thực vật và ủ ở 65oC trong ít nhất 1 giờ.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng CTAB và PEG theo Zuccarello và cộng sự (2006) [67]: thành phần dung dịch đệm chiết có chứa Tris-
HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0.1% β- mercaptoethanol, 2% CTAB và 1% PEG 6000,
* Quy trình
- Nghiền 1 g lá bằng cối chày sứ (cối, chày sứ phải vô trùng và được giữ ở -700C) trong nitơ lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn.
- Hòa tan mẫu trong 3 ml dung dịch đệm chiết có thành phần: 5 M NaCl;
1 M Tris HCl pH 8,0; 0,5 M EDTA pH 8,0; CTAB 2%, PVP 2%, β - mercaptoethanol 0,1 M, sau đó ủ ở 65o
C trong 60 phút, cứ 5 -10 phút lắc nhẹ một lần hoặc sử dụng thành phần dung dịch chứa PEG 6000: Tris - HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0,1% β - mercaptoethanol; 4% CTAB và 2% PEG 6000 sau đó ủ ở 65o
C trong 60 phút, cứ 5 -10 phút lắc nhẹ một lần. - Bổ sung 3 ml phenol - chloroform - isoamyl (25 : 24 : 1), lắc nhẹ.
- Ly tâm 12.000 v/p trong 40C, 15 phút, tạo thành 3 pha, thu lấy pha trên, chuyển sang ống ly tâm khác.
- Bổ sung 3 ml chloroform - isoamyl (24 : 1), lắc nhẹ
- Ly tâm 12.000 v/p trong 40C, 15 phút, thu lấy pha trên, chuyển sang ống epp mới, mỗi ống 300 µl.
- Tủa DNA: Cho vào mỗi ống epp 50 μl CH3COONa 3 M, 1 ml ethanol 100%. Để ở nhiệt độ -200
C trong vòng 3 giờ.
- Sau đó ly tâm 12.000 v/p trong 40C, 15 phút. Thu tủa, rửa tủa bằng 700 μl ethanol 70% 2 lần. Sấy khô bằng máy hút chân không speed vac, hòa mẫu trong 50 μl nước khử ion vô trùng. Sau đó chạy điện di kiểm tra.
cuối cùng là 100 g/ml, ủ mẫu ở 370C trong 1 giờ.
- Chạy điện di kiểm tra 5 l sản phẩm DNA thu được trên gel agarose 0,8%