Mọi nghiên cứu trên bộ gen đều được bắt đầu từ việc tách chiết DNA tổng số ở dạng tinh sạch với chất lượng tốt và lượng đủ lớn. Một trong những mối quan tâm hàng đầu khi tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các nuclease nội bào.
* Quy trình tách chiết DNA tổng số từ bèo tấm
Giống bèo tấm nguyên cây do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp, được nuôi cấy invitro trong khoảng 3-5 ngày sẽ tiến hành tách chiết DNA. Để hạn chế sự phân hủy DNA, việc tách chiết DNA được chúng tôi tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp nhằm ức chế sự hoạt động của các enzyme này. Do vậy, trước khi nghiền mẫu, cối và chày sứ được giữ trong tủ lạnh -700C. Mẫu sau đó được tiến hành nghiền trong nitơ lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn, mẫu được hòa tan trong dung dịch đệm chiết gồm các chất: Tris-HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 10 mM; 0.1% β-mercaptoethanol; 2% CTAB; 2% PVP (điều chỉnh tăng lên thêm 1% PVP so với phương pháp gốc) đối với phương pháp của Stewart và Vie (1993), còn đối với phương pháp Zuccarello và cộng sự (2006)[67] dung dịch đệm có thành phần là Tris-HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0,1% β- mercaptoethanol; 4% CTAB và 2% PEG 6000 (điều chỉnh tăng lên thêm 2% CTAB và 1% PEG 6000 so với phương pháp gốc). Hỗn hợp dung dịch đệm này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, đồng thời giải phóng DNA ra môi trường. Thành phần CTAB, PVP, PEG trong đệm chiết không những có tác dụng phá vỡ tế bào mà còn có vai trò ức chế sự hoạt động của các nuclease. Trong khi đó, EDTA lại có tác dụng cố định các ion Mg2+
(là yếu tố cần thiết cho sự hoạt động của các nuclease), nên sẽ ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết.
Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được bổ sung hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (tỉ lệ 25 : 24 : 1). Chloroform làm tăng cường hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu
trúc của DNA, đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt khí trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein đã bị biến tính, pha dưới cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol. Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý tiếp bằng hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA, bước này có thể lặp lại 1 - 2 lần.
Tiếp theo là bước kết tủa DNA bằng cách bổ sung vào dung dịch chiết CH3COONa 3M có pH 5,2 và cồn tuyệt đối. Cồn có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+
kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Ở điều kiện -200C trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Trong dung dịch này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã tiến hành loại RNA bằng cách ủ dung dịch với Rnase 0,01mg/ml ở 370
C trong 2 - 3 giờ. DNA tổng số sau đó được điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng và nồng độ.
Vì agarose là một loại polyme tách từ rong biển, được cấu tạo bởi 2 monomer là D-galactose và 3,6-anhydro L-galactose, nên sau khi đun sôi với dung dịch đệm agarose sẽ đông lại tạo cấu trúc dạng mạng lưới với kích thước lỗ phụ thuộc vào nồng độ của agarose (kích thước lỗ là 150 nm ở nồng độ 1% và 500 nm ở nồng độ 0,16%). Do có cấu trúc dạng mạng lưới, nên sau khi điện di các đoạn DNA có kích thước và trọng lượng khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc và trọng lượng phân tử của chúng. DNA tổng số có kích thước và trọng lượng phân tử lớn nhất nên dưới tác dụng của dòng điện một chiều, DNA tổng số sẽ di chuyển chậm và chiếm vị trí cao nhất trên bản gel. Những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn (do bị phân hủy) và các phân tử RNA chạy nhanh hơn tạo thành vệt sáng phía dưới vạch DNA tổng số.
Trong cấu trúc của phân tử DNA có các liên kết hydro giữa 2 mạch đơn nên trong quá trình nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào các liên kết này. Phân tử EtBr
có khả năng phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại (UV), nên ta có thể phát hiện được các băng vạch khi chiếu bản gel dưới ánh sáng UV. Sau khi nhuộm bản gel trong dung dịch EtBr 15 phút, các băng DNA đã xuất hiện rõ nét dưới ánh sáng tử ngoại. Kết quả điện di được trình bày trên hình 3.1
1 2
Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel agarose
1- DNA tổng số mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1