CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.6.2. Phương pháp khoan lỗ thạch.
Thu dịch nuôi cấy: Nuôi cấy NS trên MT xốp, ủ ba ngày ở 30oC, hòa 10g MT vào nước cất,
đem lắc trong 1h tốc độ 200 vòng/phút. Đem lọc qua vải để thu dịch lọc.
Ly tâm dịch lọc 15 phút, tốc độ 5000 vòng/phút. Thu được dịch enzyme thô.
Chuẩn bị các đĩa petri có MT thử hoạt tính các enzyme ngoại bào cần nghiên cứu. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính các enzyme ngoại bào. Dùng pipet
vô trùng nhỏ 0,1ml vào các lỗ khoan. Giữ các hộp petri trong tủ lạnh 4oC trong 8h, sau đó chuyển ra
nhiệt độ phòng 24h.
Dùng thuốc thử nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải. Kiểm tra kết quả.
Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase, pectinase, dùng thuốc thử là lugol.
NS có hoạt tính của các enzyme này sẽ tạo nên vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan.
Kiểm tra hoạt tính của protease: thuốc thử là dung dịch HgCl2. Nếu NS có sinh protease sẽ
tạo ra một vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan do protease đã phân huỷ chất cảm ứng casein,
phần còn lại có màu trắng đục do phản ứng của casein với HgCl2.
Cách pha dung dịch HgCl2: hòa 30g HgCl2 vào 100ml nước có pha với 15ml HCl.
Cách đánh giá khả năng tạo enzyme:
Dùng thước đo đường kính vòng phân giải tại mặt sau đĩa petri. D-d ≥ 25mm: hoạt tính enzyme rất mạnh.
D-d ≥ 10mm: hoạt tính enzyme trung bình. D-d ≤ 10mm: hoạt tính enzyme yếu.
Trong đó: D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính KL hoặc là đường kính của
khoan khối thạch (8mm) nếu làm bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch.