CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.13. Định danh hai chủng NS bằng phương pháp di truyền phân tử Bước 1 Chạy PCR.
Bước 1. Chạy PCR.
Nguyên tắc.
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ
sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Phương pháp PCR được hình thành dựa vào những đặc tính đó của các DNA polymerase.
Qui trình.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho
sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là
94-95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút.
- Giai đoạn lai: Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi (40-70oC), cho phép các mồi
bắt cặp với khuôn, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
- Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động
tổng hợp tốt nhất. Thời gian này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuyếch đại . Một chu kì gồm 3 bước trên được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng mẫu gấp đôi của lần trước. Đây là sự khuyếch đại theo cấp số nhân.
Cách tiến hành.
Lấy mẫu nấm nuôi cấy một lượng khoảng ½ hạt gạo cho vào một tube eppendorf.
Cho thêm 180µl TE1X vào 20 µl Prokprep rồi đem ủ ở 560C qua đêm.
Thêm 500 µl phenol Buffer và 500µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi ở 100oC
Sấy nhẹ rồi thêm vào 250 µl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex, lắc đều. Ly tâm 14000 vòng/ phút trong 10 phút.
Hút 450 µl dịch nổi sang một tube eppendorf mới. Sau đó thêm vào 500 µl Isopropanol. Giữ
tube ở nhiệt độ -20oC trong 1 đến 2 giờ.
Ly tâm 14000 vòng /phút trong 15 phút ở 4 oC. Đổ bỏ dịch nổi.
Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500 µl Ethanol 70% vào, úp ngửa tube 3-4 lần. Ly tâm 14000 vòng/ phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi.
Làm khô cặn DNA ở 56oC trong 10-15 phút.
Hòa tan cặn DNA trong 50 µl TE1X. Lấy 5µl dịch ly trích này để thực hiện kĩ thuật PCR. Lấy 5µl DNA của vi nấm sau ly trích cho vào PCR mix.
Bước 2. Điện di kiểm tra trên gel agarose.
Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer.
Bước 3. Sản phẩm PCR được tinh chế bằng kit QIAEXII của Qiagen. Bước 4. Giải trình tựđoạn RNA 28s.
Sản phẩm PCR được giải trình tự trên hệ thống ABI 3130 hoặc CEQ 8000.
Sau khi giải trình tự gen của NS nghiên cứu, tiến hành so sánh với trình tự gen trong hệ thống ngân hang gen của Mỹ để xác định chi và loài của chúng.