Ngành công nghiệp sản xuất rượu vang đã có từ lâu đời, do đó các nghiên cứu phục vụ cho ngành công nghiệp này được tiến hành tương đối nhiều và đã đạt được nhiều thành tựu, được ứng dụng khá rộng rãi trong sản xuất nhằm làm tăng sản lượng và chất lượng rượu. Một trong những hướng nghiên cứu là khảo sát việc cố định nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu vang, được thực hiện trên nhiều loại chất mang khác nhau như chất mang hữu cơ, vô cơ,…Hiện nay có khá nhiều nghiên cứu khảo sát quá trình cố định nấm men trên vật liệu trái cây mà điển hình là trái táo. Đây là hướng nghiên cứu mới mẻ, hứa hẹn sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cho ngành sản xuất rượu vang.
5.1.1 Sản xuất rượu vang từ nấm men cố định trên táo lên men gián đoạn ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp [20]
Nghiên cứu này do Y. Kourkoutas, M.Komaitis, A.A. Koutinas và M. Kanellaki thực hiện năm 2001. Trong nghiên cứu này, nấm men được cố định trên táo và ứng dụng vào quá trình lên men gián đoạn dịch nho khảo sát ở nhiệt độ từ 25°C xuống 1°C. Người ta thấy rằng hoạt tính của nấm men cố định không hề giảm ngay cả khi lê men ở nhiệt độ thấp như 1 ~12°C. So với lên men rượu sử dụng tế bào tự do thì quá trình lên men sử dung nấm men cố định rút ngắn thời gian hơn, đặc biệt ở nhiệt độ 6°C, thời gian lên men là 8 ngày. Còn ở nhiệt độ 1°C thời gian là 1 tháng do đó có thể ứng dụng vào công nghiệp để nâng cao quá trình lên men.
Giống nấm men: được sử dụng là giống AXAZ-1, là giống Saccharomyces
cerevisiae có khả năng chịu được cồn, ưa lạnh được thu từ 1 vùng nông nghiệp ở
Hy Lạp. Nấm men chủng AXAZ-1 được phân lập trên quả nho từ các vườn nho trồng ở Ano-Ziria Bắc Pelopnonioassi. Dịch nho lên men có nổng độ đường cao (17,5 và 17,7Be). Nấm men được lên men trong dịch nho đã loại bỏ vỏ. Trước khi quá trình lên men kết thúc, lấy 1ml sinh khối cho vào 5ml môi trường gồm có: 2% glucose, 0.1% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4, 0,5% MgSO4, và 0,4% cao nấm men,
70
hỗn hợp sẽ được ủ ở nhiệt độ 30C. Sau đó hỗn hợp sẽ được lọc thu sinh khối nấm men. Loại nấm men này sống được trên môi trường : 4% glucose, 0,1% (NH4)2SO4 , 0,15% KH2PO4 và 0,5% MgSO4. Lượng nấm men cần dùng khoảng 15-20g.
Dịch lên men: Nho được ép lấy dịch và điều chỉnh về dung dịch có nồng độ
đường từ 12-14Be. Sau đó, dịch sẽ được sục khí SO2 với nồng độ 1,5g/l hoặc hơn nữa. Và đem tiệt trùng ở 130C trong 15 phút.
Xử lý chất mang và cố định tế bào: Để cố định tế bào vi sinh vật với chất
mang là táo, đầu tiên táo sẽ được cắt thành miếng nhỏ (có thể hình khối lập phương 1cm). Sử dụng khoảng 425g miếng táo này được đặt trong một cốc thủy tinh hình trụ 1l và bổ sung vào 500ml môi trường lên men. Môi trường gồm 12% glucose, 0,4% cao nấm men, 0,1% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4 trong nước cất và pH đạt 5,6. Không cần điều chỉnh pH.
Sau đó10g sinh khối nấm men đã qua xử lý như trên sẽ được bổ sung vào cốc thủy tinh và cho lên men cho tới khi dung dịch có nồng độ đường 0,5 Be, thời gian khoảng 8 giờ. Hỗn hợp lên men đó sẽ được lọc gạn và chất mang sẽ được rửa hai lẩn với 400ml dịch nho chuẩn bị cho quá trình lên men rượu.
Sau đó nấm men cố định trên táo sẽ được đem đi lên men rượu trong dịch nho có nồng độ 12Be ở nhiệt độ thường và nhiệt độ thấp. Người ta khảo sát ở nhiều giá trị nhiệt độ khác nhau, giảm dần từ 25, 20, 15, 12, 9, 6 và 1°C . Lên men lần đầu trong 400ml dịch, nhưng từ lần hai trở đi mỗi lần lên men trong 300ml dịch, do sự giảm thề tích của táo. Tổng cộng thực hiện 30 lần lên men. Sau mỗi lần lên men ta tiến hành kiểm tra lượng cồn tạo thành, đường còn lại, số lượng tế bào và hàm lượng acid trong dịch lên men.
Thể tích của chất mang táo cố định nấm men trong dụng cụ được quan sát sau 12 lần lên men đầu. Dịch lên men của mỗi lần phải dùng có nồng độ đường là 12Be. Khi số lần lên men tăng thì thể tích của chất mang táo giảm dần trong 7 lần đầu tiên. Rồi sau đó thể tích của chất mang táo không giảm nữa cho tới khi kết thúc quá trình lên men. Điều này được giải thích là do lúc đầu nấm men đã sử dụng đường trong táo để chuyển hóa thành ethanol cho tới khi hết đường, chỉ còn
71
cellulose và các thành phần khác không tham gia vào quá trình lên men. Do đó từ những lần sau trở đi thể tích của chất mang táo không giảm đi nữa.
a) b)
Hình 5.1: a) Táo làm chất mang cố định nấm men trong lên men rượu
b) Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử nấm men cố định trên táo
Hình 5.2: Sự giảm thể tích của táo theo số lần lên men
Toàn bộ thời gian lên men kéo dài trong 7 tháng. Ngay cả ở nhiệt độ thấp từ 1-9C nấm men vẫn hoạt động. Đặc biệt hơn nữa là ở nhiệt độ 6C quá trình lên men chỉ diễn ra trong 8 ngày ngắn hơn thời gian lên men tự nhiên đòi hỏi. Còn ở
72
nhiệt độ 1C thời gian lên men là một tháng, giúp đẩy nhanh quá trình sản xuất rượu công nghiệp. Kết quả trên cho thấy với lượng đường còn lại sau khi lên men, ta có thể sử dụng phương pháp lên men này trong sản xuất rượu vang khô. Lượng cồn thu được cao hơn ít nhất 10 độ so với phương pháp lên men tự nhiên. Lượng acid tổng trong sản phẩm cao hơn so với rượu vang khô một chút do sự chuyển hàm lượng acid trong táo vào rượu trong quá trình lên men hoặc tổng hợp them acid. Hàm lượng acid vẫn nằm trong giới hạn cho phép của rượu vang khô là 4-6g acid tartaric/lit, ở nhiệt độ từ 25-12C, lượng acid tổng tạo ra từ 4,5-5,5 g acid tartaric/lit, nhưng nếu tiếp tục giảm nhiệt độ xuống (9-1C) thì hàm lượng acid có xu hướng giảm nhẹ do sự kết tinh acid tartaric ở nhiệt độ thấp.
Sản phẩm phụ dễ bay hơi: Rượu bậc cao: nhìn chung thì hàm lượng rượu
bậc cao như propanol-1, isobutyl alcohol tạo thành là thấp. Nhiệt độ lên men càng giảm thì lượng rượu bậc cao tạo thành càng giảm, cụ thể như hàm lượng rượu bậc cao tạo thành tại nhiệt độ lên men 1C chỉ bằng 20% ở 25%, và do đó làm tăng chất lượng rượu vang. Ethyl acetate: hàm lượng ethyl acetate tăng khi nhiệt độ lên men giảm, gần đạt tới 154 mg/l, nhưng không có mùi giấm trong sản phẩm mà nó toàn là mùi trái cây.
Hình 5.3: Phần trăm ethyl acetate và rượu bậc cao trong lượng acid tổng theo nhiệt
độ
Các hợp chất hóa học dễ bay hơi khác: acetaldehyde thường ở mức 13-40 mg/l, nhưng có thể đạt tới 75 mg/l. Trong nghiên cứu này, nồng độ acetaldehyde cao nhất là 53mg/l,còn đa số trường hợp còn lại thì thấp hơn. Methanol hình thành
73
từ hợp chất pectin từ phản ứng ester hoá trong thực vật và vi sinh vật. Lượng methanol tạo thành trong lên men cố định nấm men trên táo đều nhỏ hơn 100mg/l, còn trong lên men không cố định là 0,1-0,2g/l.
Người ta đã sử dụng phương pháp phân tích GC-MS để so sánh thành phần các chất tạo hương trong rượu vang sử dụng tế bào cố định trên chất mang táo và sản phẩm rượu vang truyền thống. Kết quả cho thấy thành phần các cấu tử hương trong cả hai mẫu đều giống nhau như là ethanol, acetic acid ethyl ester, 2-methyl-1- propanol, 3-methyl-1-butanol, 2-methyl-1-butanol, acetic acid butyl ester, 3- methylbutyl acetate, 2-methylbutyl acetate, butanoic acid ethyl ester, 2methylbutyric acid ethyl ester, 1-hexanol, hexanoic acid ethyl ester, phenyl ethyl alcohol, octanoic acid ethyl ester, and acetic acid 2-phenylethyl ester. Ester là nhân tố tạo mùi quan trọng, tạo hương vị đặc trưng cho rượu. Tuy nhiên người ta còn thấy trong mẫu rượu vang có thêm các acid béo C6, C8, C10 và một số acid mà được cho là làm tăng mùi vị cho rượu vang. Qua kết quả phân tích GC-MS, ta thấy lên men bằng tế bào cố định cho tất cả các hợp chất dễ bay hơi tương tự như lên men bằng phương pháp truyền thống. Điều đó chứng tỏ không có sự khác biệt gì về sản phẩm so với phương pháp cũ.
Kết quả thí nghiệm cảm quan: sản phẩm có hương vị trái cây, vị thơm ngon khi sử dụng tế bào cố định trên táo lên men ở nhiệt độ thấp.
Kết luận: sản xuất rượu bằng tế bào cố định trên táo ở nhiệt độ thấp là phương pháp lên men tốt và hữu hiệu, nâng cao hiệu suất và chất lượng sản phẩm. Đây là nghiên cứu đầu tiên nhưng khách quan xác định giá trị sản phẩm rượu sản xuất bằng tế bào cố định trên táo, và đưa ra 2 kết luận: một là sản xuất được loại rượu ngon và có hương vị đăc trưng, hai là một lượng lớn táo, trước đây không được sử dụng làm ô nhiễm môi trường, nay được sử dụng 1 cách có hiệu quả.