4.2.2.1 Cơ chế của sựlên men rượu ethylic
Lên men cồn là lên men kỵ khí nhằm chuyển hóa đường, chủ yếu là glucose và fructose, thành ethanol và khí carbon dioxide. Quá trình này, được thực hiện bởi nấm men và cũng có thể do một số vi khuẩn như Zymomonas mobilis, có thể được tóm tắt bằng phản ứng chung sau: [13s]
Tuy nhiên thực tế thì quá trình lên men rượu là quá trình phức tạp hơn nhiều. Cùng lúc xảy ra phản ứng trên, rất nhiều các biến đổi hóa sinh, hóa học và hóa lý cũng xảy ra làm cho dịch nước nho có thể chuyển hóa thành rượu. Ngoài sản phẩm là etanol, rất nhiều các hợp chất khác cũng được sinh ra trong quá trình lên men cồn như rượu cao phân tử, ester, glycerol, acid succinic, diacetyl, acetoin và 2,3- butanediol. Đồng thời, một số hợp chất của trái nho cũng bị biến đổi do sự trao đổi chất của nấm men. Nếu không có sự tạo thành của các hợp chất này, thì sản phẩm rượu vang sẽ ít có giá trị cảm quan hơn.
Bắt đầu quá trình làm rượu vang, một vài loài nấm men có thể có mặt trong dịch ép nho. Sự đa dạng về chủng loại nấm men phụ thuộc vào một số yếu tố như giống nho, thời điểm thu hoạch, các phương pháp kháng nấm, điều kiện khí hậu,… Tuy nhiên, các yếu tố khác cũng quan trọng như quá trình thu hoạch, vận chuyển , đặc biệt hoạt động nhà máy,…
Nhiều giống nấm men khác nhau tham gia vào quá trình lên men rượu tự phát. Thông thường Kloeckera, Hanseniaspora và Candida hoạt động trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Sau đó, Pichia và Metschnikowia hoạt động trong giai đoạn giữa. Cuối cùng, giai đoạn sau của quá trình lên men, Saccharomyces
cerevisiae chiếm ưu thế do nó có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao Một số
nấm men khác, như Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosacchaomyces, Zygosaccharomyces và Brettanomyces cũng có thể có mặt trong quá trình lên men rượu và có thể gây ra một số biến đổi cảm quan.
43
Sự phát triển của nấm men trong quá trình lên men rượu:
Đầu quá trình làm rượu vang, các nấm men bắt đầu chuyển hóa các loại đường và các chất dinh dưỡng khác hiện diện trong nước ép nho. Các nấm men sử dụng tất cả các chất dinh dưỡng này để cung cấp năng lượng và tăng số lượng.
Hình 4.5: Đường cong sinh trưởng của nấm men [13]
Quá trình lên men rượu của nấm men được chia thành các giai đoạn:
Quá trình đường phân:
Quá trình lên men rượu là một quá trình phức tạp. Đầu tiên đường thẩm thấu vào trong tế bào nấm men ở đó đường chuyển hóa qua hàng loạt các sản phẩm trung gian, thẩm thấu và cuối cùng tạo thành axit pyruvic. Acid pyruvic sinh ra do quá trình đường phân sẽ được nấm men sử dụng trong nhiều quá trình chuyển hóa sau đó, như là quá trình lên men hoặc hô hấp.
44
45
Quá trình chuyển hóa acid piruvic thành rượu:
Acid pyruvic dưới tác dụng của enzyme Pyruvat decarboxylase tạo thành acetaldehyde ( enzyme này có Coenzyme là thiamin, và cần có Mg2+ làm chất hoạt hóa. Sau đó acetaldehyde bị khử thành cồn athylic do enzyme alcol dehydrogenase xúc tác ( enzyme này có phân tử lượng là 151000 có chứa 4 tâm hoạt động độc lập và 4 nguyên tử Zn, coenzyme của enzyme này là NAD). Phương trình tổng quát như sau:
46
47
Các sản phẩm phụ của quá trình lên men:
Diacetyl, acetoin và 2,3-butanediol: Những hợp chất này được sinh ra trong các phản ứng. Acetoin và đặc biệt là diacetyl tạo mùi, góp phần làm tăng hương vị cho rượu vang. Mặc dù quá trình lên men rượu không sinh ra acetoin và diacetyl đủ để có thể tạo nên hương vị rượu vang, nhưng sau đó sự phát triển của vi khuẩn acid lactic có thể tăng đáng kể nồng độ của nó.
Ethanal: Ethanal, còn được gọi là acetaldehyde, là một sản phẩm trung gian
của quá trình lên men rượu. Sau đó, ethanal chuyển thành ethanol, nhưng số lượng nhỏ có thể còn trong rượu. Ethanal cho một hương thơm đặc trưng góp phần vào mùi đặc trưng của rượu vang
Acetic acid: axit axetic là acid dễ bay hơi chính của rượu vang. Sự hiện diện
của acid acetic với nồng độ cao tạo ra mùi dấm, và tạo cảm giác một bất tiện trong miệng. Acid axetic có thể được sinh ra bởi nấm men, vi khuẩn acid lactic và vi khuẩn acid acetic. Nhưng thông thường Saccharomyces cerevisiae chỉ sinh ra acid acetic với lượng nhỏ (0,1- 0,3 g/l). Tuy nhiên, quá trình lên men chậm có thể tạo ra một số lượng lớn axít này.
Rượu cao phân tử: được sinh ra do sự chuyển hóa của các các axit amin.
Rượu cao phân tử là tiền chất của một số este.
Este: este được tổng hợp từ acyl-CoA và rượu bởi một nhóm các enzyme, rượu-acylcoAtransferases (Barre et al 1998). Về cơ bản có hai loại este trong rượu vang: acetates của rượu phân tử và các este của axit béo và ethanol. Các este này cho ra mùi khác nhau, như keo (ethyl acetate), chuối (isoamyl acetate) hoặc hoa hồng (phenylethanol acetate). Các nhóm khác este được tổng hợp từ các CoA -acyl khác nhau và ethanol. Sự khác nhau về axit béo và ethanol làm cho ra một mùi hương trái cây.
Axit succinic: succinic acid là sản phẩm thứ ba của quá trình lên men rượu.
Một số tác giả cho rằng acid succinic được tổng hợp thông qua chu trình Krebs (Heerde và Radler 1978). Acid succinic có trong rượu vang với nồng độ từ 0,6 và 1,2 g / l và nó góp phần đáng kể vào vị chua của rượu vang. Saccharomyces
48
cerevisiae cũng tổng hợp vào một số rượu vang khác axit như axit lactic, isovaleric và isobutyric axit, axit béo, vv, nhưng chỉ ở nồng độ thấp
49
4.2.2.2 Các tác nhân ảnh hưởng đến lên men rượu vang
Nhiệt độ
Nhiệt độ môi trường có ý nghĩa rất quan trọng với sự phát triển và lên men của nấm men. Nhiệt độ tối ưu cho nấm men phát triển: 24-28C.Nếu giảm nhiệt độ sẽ ức chế sự phát triển của nấm men. Khi tăng nhiệt độ quá 30C sẽ tăng quá trình sinh sản của nấm men (thường xảy ra vài giờ ) và tăng nhanh quá trình lên men (2- 4 ngày) .Nhưng trong điều kiện này, nấm men rất dễ bị tiêu diệt và trong dịch lên men còn lại rất nhiều đường không lên men. Nếu nhiệt độ tăng quá 40C thì sự phát triển của nấm men hoàn toàn bị ngừng trệ. Ngoài ra, nấm men còn có khả năng chịu được nhiệt độ thấp, chúng có thể tồn tại được ở -200C mà không bị tiêu diệt trong vài giờ.
Nhiệt độ lên men cao nhất là 39C và thấp nhất là 4÷6 C .
Nhiệt độ thích hợp cho nấm men rượu vang từ 22÷ 27C (ảnh hưởng tốt đến sinh sản và trao đổi chất). Nhiệt độ thích hợp nhất để lên men nguyên liệu sản xuất rượu Champagne là 15÷ 20C, tàng trữ ở 9÷11C. Đối với rượu vang trắng dùng để sản xuất Cognae là 18÷22C.
Sự lên men ở nhiệt độ thấp tốt hơn là sự lên men ở nhiệt độ cao. Bởi sự lên men ở nhiệt độ thấp ức chế sự phát triển của nấm và men dại. Những vi sinh vật gây hư hỏng rượu vang ở nhiệt độ thấp thường không phát triển hoặc phát triển yếu. Lên men ở nhiệt độ thấp giúp cho quá trình tạo hương vị tốt. Khi lên men ở nhiệt độ cao, thích hợp cho sự phát triển vi khuẩn và nấm men dại, nhất là vi khuẩn acetic và vi khuẩn lactic. Rượu vang thu được có chất lượng kém.
pH môi trường:
pH môi trường lên men ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của nấm men. Những pH tốt thích hợp cho sự phát triển và lên men rượu của nấm men không cố định. pH này phụ thuộc nhiều yếu tố, cụ thể những yếu tố chính sau :
- Loại chủng nấm men
50 - Điều kiện lên men ( nhiệt độ )
Đối với các loại nấm men rượu vang, pH tối thích của chúng khoảng từ 4÷5, của nấm men bia là 6, của nấm men rượu là 4÷ 4,5, của đa số các loại nấm là 3,5 .
Nấm men có khả năng phát triển ở môi trường trung tính, kiềm, nhưng lên men rượu tốt nhất là ở môi trường acid và đặc tính chịu được độ acid cao của một số loại nấm men.
Đối với nấm men giống Saccharomyes, giới hạn pH môi trường có thể phát triển được là thấp nhất 2,0÷2,4, cao nhất là 12. Ở pH = 8÷11, đa số nấm men hô hấp hiếu khí hơn là lên men.
Ngoài ra, pH môi trường còn có ảnh hưởng đến các enzym hình thành trong nấm men. Theo nghiên cứu của Haldane thi 96 enzym có pH tối thích từ 4-8 , ở pH <4, hoạt tính của các enzym bắt đầu yếu dần.
Trong quá trình lên men rượu, một số acid có thể được hình thành thêm, dẫn đến sự hạ thấp pH xuống.
Nồng độ đường của dịch lên men:
Các loại dịch quả, dịch đường hóa, mật rĩ loảng đều tạo nên một áp suất thẩm thấu. Áp suất này càng tăng khi gia tăng nồng độ đường của môi trường. Các vi sinh vật phát triển trong môi trường này đều phải chịu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu. Các nấm men đều phải có khả năng cân bằng áp suất thẩm thấu của môi trường với áp suất nội thể, trường hợp ngược lại, nấm men sẽ bị co nguyên sinh. Trong dung dich đường sacharose nồng độ 25%, nấm men phải chịu áp suất là 23atm, trong dung dịch đường glucozo 25%, áp suất là 58atm.
Từng loại nấm men riêng biệt có khả năng chịu đựng áp suất thẩm thấu khác nhau. Những nòi nấm lên men nổi, có đặc tính là khả năng chịu đựng áp suất thẩm thấu lớn hơn các nòi khác. Những nấm men của giống Zygosaccharomyces có thể phát triển trong nước nho đặc với hàm lượng từ 50÷80%. Trọng lượng (tương ứng với áp suất thẩm thấu 120÷ 250atm), thông thường những nấm men này phát triển trên bề mặt của môi trường.
51
Người ta đã chứng minh rằng, với sự gia tăng nồng độ đường trong môi trường sẽ kéo dài thời gian lên men, và hiệu suất rượu từ một đơn vị đường sẽ giảm, lượng rượu tạo ra không đáng kể. Phần lớn với nấm men rượu vang, sự gia tăng nồng độ đường lên trên 30% thì nhận thấy sự giảm dần hiệu suất cồn etylen, với nồng độ đường quá cao thì quá trình lên men sẽ dừng lại ở 5÷6% thể tích. Nguyên nhân là phần lớn tế bào nấm men đã chết do hiện tượng co nguyên sinh. Ngoài ra sự lên men trong môi trường có nồng độ đường cao thường dẫn đến hiện tượng acid bay hơi tạo thành trong môi trường cao. Để tránh hiện tượng này cũng như để tăng hiệu suất rượu cao hơn có thể cho lượng đường dư vào từ từ, (hoặc chia làm nhiều lần cho vào) thay vì cho cùng một lúc.
Bendensvin đã làm thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự lên men cồn etylic của loài nấm men và được kết quả như sau:
Tăng lượng đường sẽ ức chế, làm giảm khả năng lên men của nấm men. Bắt đầu từ nồng độ đường tối ưu 30%, khả năng lên men bắt đầu giảm. Những nấm men chịu được nồng độ rượu cao là những nấm men chịu được áp suất thẩm thấu của đường mạnh.
Nồng độ cồn etylen:
Cồn etylen là sản phẩm chính tạo ra trong quá trình lên men rượu của đường. Nhưng nó có thể ức chế hoạt động của nấm men. Nồng độ rượu 1,5% thể tích đã phần nào ức chế sự phát triển và phát triển của nấm men. Khi tăng lên đến 5% thể tích thì sự sinh sản bắt đầu ngưng trệ. Nếu nồng độ rượu lên đến 7-8% thể tích thì bắt đầu giảm giai đoạn lên men mạnh nhất và bắt đầu lên men giai đoạn yếu.
Ảnh hưởng nồng độ etylen vào các loại nấm men không giống nhau. Đa số loại nấm men ở điều kiện nhiệt độ tối ưu chịu được nồng độ cồn khoảng 14÷16% thể tích.
52
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến một số loại nấm men [5]
Loại nấm men Nồng độ cồn cực đại nấm men có thể tồn tại Saccharomyces oriformis 18÷19 Hanseniaspore 4÷5,9 Sacharomyces pasteurianus 10 Sacharomyces ellipsodens 18
Nấm men rượu vang 18÷19
Nấm men rượu 4÷5
Thời gian:
Thời gian là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng đến chất lượng sản phẩm rượu vang. Thời gian lên men phụ thuộc nhiều yếu tố : nhiệt độ lên men,nồng độ đường, chủng nấm men… Thời gian lên men bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men , qua các giai đoạn sinh sản , phát triển , bắt đầu lên men ,lên men mạnh, lên men yếu… Người ta chưa xác định rõ khi nào là lên men kết thúc. Thường người ta xác định điểm kết thúc lên men bằng cách nếm khi không còn cảm giác vị ngọt của đường hoặc bằng cách quan sát thấy khả năng tạo CO2 rất yếu .Ở đây chỉ nói đến thời gian kết thúc giai đoạn lên men chính . Giai đoạn lên men phụ là giai đoạn ủ chin và tàng trữ kéo dài từ vài tháng trở lên
Khí sunfuaro (SO2):
Nấm men so với các loại sinh vật khác, rất bền với SO2. Do đó người ta thường xông khí SO2 vào thùng lên men để thanh trùng trong sản xuất rượu vang. Tuy nhiên, với nồng độ quá cao, SO2 có thể làm ức chế quá trình lên men của nấm men. Để tăng khả năng chịu đựng SO2 của nấm men bằng cách nuôi nấm men liên tục trong những môi trường có hàm lượng SO2 tăng dần để tạo sự thích ứng của nấm men với SO2.
Theo N.K. Mogilanski ,hàm lượng SO2 trong môi trường cao sẽ kéo dài thời gian lên men.
53
- Với nồng độ 50mg/l SO2 sẽ kéo dài thời gian lên men 18÷ 24h - Với nồng độ 100mg/l SO2 sẽ kéo dài thời gian lên men 5÷6 ngày. - Với nồng độ 1000-1500mg/l SO2 sẽ kéo dài thời gian lên men 1 năm.
Dựa vào đặc tính này người ta có thể tàng trữ nước quả bằng cách xông SO2
Theo kết quả trên ,nhận thấy rằng với hàm lượng SO2 khá cao , trong môi trường lên men sẽ đình chỉ sự lên men, nhưng nấm men vẫn không chết . Nếu cho nâm men vào lại môi trường chứa Sunfit hoá thì chúng sẽ bắt đầu phát triển trở lại.
Nồng độ O2 của môi trường
Sự cung cấp lượng oxy cần thiết cho giai đoạn phat triển của nấm men, đó là giai đoạn tăng sinh khối nấm men ở giai đoạn đầu khi cho nấm men vào dịch lên men.
Độ thoáng khí của môi trường ngược lại rất bất lợi cho quá trình lên men rượu . Khi bắt đầu sang giai đoạn lên men, sự lên men phải xảy ra trong giai đoạn yếm khí hoàn toàn. Ở điều kiện này, sự phát triển của những vi sinh vật cần oxy bị cản trở ( như vi khuẩn acetic, các loại nấm men dai.)
Trong môi trường này , sự hô hấp của nấm men bị ức chế và bắt đầu tìm năng lượng cần thiết để lên men.
Để đáp ứng năng lượng cần thiết, nấm men cần phân hủy một lượng đường lớn và đường sẽ chuyển thành rượu etylic, CO2. Đó chính là nguyên nhân muốn có được cồn nhiều thì không được thông khí cho môi trường.
Nồng độ CO2 trong môi trường:
CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường: Một phần được tồn tại trong môi trường, một phần tách lên trên bề mặt môi trường, một phần tích tụ thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường.
CO2 tích tụ trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không làm yếu khả năng lên men của chúng.
Theo Mule Turgan, với nồng độ 0,25%, trọng lượng CO2 trong môi trường sẽ ức chế sinh sản của nấm men rượu vang.
54
Theo Smitener, sự sinh sản của nấm men ngừng lại khi nồng độ CO2 lên đến 1,5% trọng lượng, với lượng CO2 này tương ứng với áp suất 7,7 atm ở 15C.
Khi môi trường chứa hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp.
CO2 nằm trong khoảng không giữa bề mặt môi trường và không khí có tác dụng kiềm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại. Do vậy, các thùng lên men phải dùng nút bằng nguyên liệu đặc biêt, chỉ cho phép CO2 bay ra mà không cho không khí vào.