Phương pháp cố định bằng liên kết chéo giữa các tế bào vi sinh vật:
Định nghĩa: Các tế bào liên kết với nhau thành một khối tế bào. Sự liên
kết giữa các tế bào được xem như một phương pháp cố định tế bào do sự kết tụ lại của các tế bào làm cho chúng có thể được sử dụng trong các thiết bị phản ứng. Phương pháp này được xem xét là có thể xảy ra ở các loại nấm men, nấm mốc và tế
22
bào thực vật. Sự kết tụ của các tế bào nấm men là một ứng dụng quan trọng trong ngành sản xuất rượu vang do sự ảnh hưởng tới quá trình lên men và tách tế bào nấm men ra khỏi sản phẩm. Sự liên kết giữa các tế bào nấm men Saccharomyces cerevisia có ứng dụng quan trọng vào ngành công nghiệp sản xuất thức uống có cồn.
Tác nhân liên kết:glutaraldehyde, toluene diisocyanate, hexamethylence
Vai trò của tác nhân:
- Có tính thẩm thấu nhanh chóng vào tế bào vi sinh vật. - Nước được liên kết với thành tế bào vi sinh vật.
Phương pháp cố định bằng màng chắn membrane (màng lọc)
Định nghĩa: Tế bào được chứa trong một lớp màng lọc hoặc trong vi
bao. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật này thích hợp khi hoạt động trao đổi chất ít xảy ra. Kỹ thuật cố định vi sinh vật bằng vi bao đã được ứng dụng rộng rãi đặc biệt là vào ngành sản xuất rượu, một ví dụ là sản phẩm “Milispark”, được nâng cao từ “Milipore”. Một nhược điểm của phương pháp cố định tế bào bằng phương pháp vi bao là sự hạn chế của hoạt động trao đổi chất và có thể bị tắc ngẻn do tế bào tăng trưởng. Ngoài ra còn có nhược điểm là chuyên biệt đối với mỗi loại vi sinh vật.
Yêu cầu của tế bào vi sinh vật cốđịnh:
- Các chất mang thích hợp cho cố định tế bào được sử dụng trong ngành sản xuất thức uống có cồn cần phải đạt những yêu cầu sau:
- Chất mang phải có diện tích bề mặt lớn, và phải có vị trí cho tế bào vi sinh vật bám vào.
- Chất mang phải dễ dàng xử lý và có thể tái sử dụng được.
- Số tế bào còn sống và sự ổn định của chất xúc tác sinh học phải cao và duy trì trong thời gian dài.
- Các hoạt động sinh học của tế bào cố định không bị ảnh hưởng bất lợi bởi quá trình cố định tế bào. Các lỗ xốp của chất mang phải thống nhất và kiểm soát, cho phép sự tự do trao đổi các cơ chất, sản phẩm, cofactor và khí. Vật liệu làm chất mang phải ổn định, không dễ dàng bị phân hủy bởi các tác nhân hóa học,
23
nhiệt, sinh học, không bị xúc tác bởi các enzyme, dung môi, áp lực. Chất mang và phương pháp cố định phải đơn giản, dễ dàng, hiệu quả về chi phí.
- Chất mang phải an toàn về mặt thực phẩm, không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm nếu như còn sót lại.
Ưu nhược điểm các phương pháp thông dụng để cố định tế bào [5] 1- Hấp phụ lên bề mặt rắn:
Ưu điểm:
- Quá trình thực hiện đơn giản
- Điều kiện nhẹ nhàng nên đảm bảo khả năng sống của tế bào.
Nhược điểm:
- Tế bào dễ bị tách khỏi chất mang do tác động cơ học hoặc khi thay đổi môi trường.
- Số lượng tế bào cố định thường thấp. - Quá trình cố định thụ động khó điều khiển
2- Liên kết cộng hóa trị với chất mang.
Ưu điểm:
- Khả năng trao đổi chất cao.
- Độ bền liên kết giữa tế bào và chất mang tốt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhược điểm:
- Thường ảnh hưởng đến sự sống và hoạt tính của tế bào - Mỗi tế bào phải có phản ứng đặc thù.
3- Liên kết giữa các tế bào
Ưu điểm:
- Điều kiện nhẹ nhàng, khả năng kéo dài thời gian hoạt động của tế bào Nhược điểm:
- Độ bền cơ học kém.
4- Bao tế bào bằng màng chắn
Ưu điểm :
- Mật độ tế bào cố định lớn. - Khả năng trao đổi chất tốt.
24
Nhược điểm:
- Độ bền cơ học kém.
- Sự sinh trưởng tế bào dễ phá hủy màng chắn.
5- Bọc tế bào trong hệ thống lỗ xốp.
Ưu điểm:
- Mật độ tế bào lớn. - Độ bền cơ học cao.
- Ứng dụng cho nhiều loại tế bào khác nhau. Nhược điểm:
- Cản trở sự trao đổi chất của tế bào. - Có thể ảnh hưởng đến hoạt tính tế bào.
3.4 Ưu nhược điểm của vi sinh vật cố định so với vi sinh vật tự do
3.4.1 Ưu điểm:
Việc sử dụng tế bào vi sinh vật cố định vào sản xuất thức uống có cồn có nhiều thuận lợi hơn việc sử dụng tế bào tự do ở những điểm sau:
- Kéo dài thời gian hoạt động và ổn định của các tế bào này. Đồng thời chất mang cố định cũng được xem như nhân tố bảo vệ tế bào chống lại các tác nhân ảnh hưởng như pH, nhiệt độ, dung môi, kim loại nặng,..
- Tăng hấp thu cơ chất và cải thiện năng suất. - Có khả năng lên men liên tục.
- Tăng sức chịu đựng với nồng độ cơ chất cao, giảm sự ức chế của sản phẩm cuối.
- Có khả năng lên men nhiệt độ thấp nâng cao chất lượng sản phẩm. - Sản phẩm được thu hồi dễ dàng hơn do giảm bớt quá trình tách chiết và lọc do đó làm giảm chi phí yêu cầu về thiết bị và năng lượng.
- Có khả năng tái sử dụng trong quá trình lên men mà không cần loại bỏ khỏi môi trường.
- Giảm khả năng nhiểm vi khuẩn do mật độ tế bào cao và quá trình lên men.
25
- Có khả năng sử dụng các thiết bị phản ứng đơn giản, nhỏ do đó làm giảm chi phí.
- Giảm thời gian tạo thành sản phẩm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Những ưu điểm ở trên được rút ra từ những nghiên cứu về các phương pháp cố định và ứng dụng của nó vào sản xuất các thức uống có cồn như rượu vang, bia, và cồn uống được. [5]
3.4.2 Nhược điểm:
- Hoạt lực thấp hơn tế bào tự do
- Trong môi trường phản ứng, không tránh khỏi hiện tượng rửa trôi tế bào ra khỏi chất mang
- Cơ chất muốn vào trong tế bào để trao đổi chất tạo thành sản phẩm phải qua chất mang. Vì thế phải lựa chọn chất mang phù hợp với kỹ thuật cố định để làm giảm trở lực của quá trình thẩm thấu vào ra của sản phẩm. [5]
3.5 Giới thiệu chất mang trái táo và phương pháp cốđịnh trên chất mang táo
3.5.1 Trái táo
3.5.1.1 Giới thiệu
Trái táo, tên khoa học Malus domestica, là một loại trái cây khá phổ biến, được trồng ở các vùng địa lý giữa vĩ độ 30 và 60 ở cả bắc bán câu và nam bán cầu. Táo thuộc họ Rosacea. Chúng thích nghi tốt với khí hậu ôn đới, những nơi mà có ít nhất 2 tháng khí hậu lạnh. Việc ra quả bắt đầu vào cuối mùa xuân, khi cây bắt đầu ra hoa nhìn giống như bông hồng nhỏ. Hoa tạo thành phấn hoa và mật hoa hấp hẫn ong và những loại côn trùng khác thụ phấn cho hoa, trái chin trong khoảng 140-170 ngày. Một cây táo có thể cho trái từ 6-8 năm. Do những thuận lợi trong sản xuất, bảo quản, phát triển sản phẩm, giá trị thương mại nên trái táo được sử dụng phổ biến vào công nghiệp sản xuất, đặc biệt là ngành công nghiệp sản xuất rượu.
Cây táo cao khoảng 3-12 m, tán rộng và rậm. Đến thu cây rụng lá. Lá táo hình bầu dục, rộng 3-6 cm, dài 5-12 cm; đầu lá thắt nhọn với cuống lá (petiole) khoảng 2-5 cm. Rìa lá dạng răng cưa.
26
Hoa táo nở vào mùa xuân cùng lúc khi mầm lá nhú. Hoa sắc trắng, có khi pha chút màu hồng rồi phai dần. Hoa có năm cánh, đường kính 2,5-3,5 cm. Trái chín vào mùa thu và thường có đường kính cỡ 5-9 cm.Ruột táo bổ ra có năm "múi" (carpel) chia thành ngôi sao năm cánh. Mỗi múi có 1-3 hột. [26]
Braeburn Golden Delicious Granny Smith
Hình 3.2: Các loại táo được dùng để sản xuất rượu vang
Mặc dù nhiều giống táo đều có thể được thu hoạch trong tháng 8 và đầu tháng 9, nhưng phần lớn táo ở Mỹ đều được thu hoạch vào cuối tháng 9 và suốt tháng 10. Táo phải được bảo quản ở nhiệt độ 0C hoặc -1C với độ ẩm từ 92-95% thì giữ được trong một thời gian ngắn. Với điều kiện bảo quản thích hợp, sau khi thu hoạch táo có thể để được 12 tháng.
Táo được trồng nhiều ở các nước ôn đới, khả năng thích nghi của chúng khá cao, từ những nới có khí hậu khắc nghiệt như Siberia, bắc Trung Quốc cho đến những vùng có khí hậu ấm như Columbia và Indonesia. Có trên 60 quốc gia trên thế giới sản xuất trên 1000 tấn mỗi năm như Trung Quốc, Mỹ, Thổ Nhĩ Kỳ, Iran, Pháp, Ý, Ba Lan và Nga, …Trái táo là một trong những loại trái cây có sản lượng dẫn đầu trên thế giới. Theo Food and Agriculture Organization (FAO), tổng sản lượng của trái táo trên thế giới vào năm 2004 ước tính khoảng 57 triệu tấn, và Hoa Kì và Trung Quốc dẫn đầu về sản lượng vào khoảng 36% và 7% sản lượng của thế giới.
27
Bảng 3.1: Sản lượng táo (theo tấn) ở các quốc gia trên thế giới [25]
3.5.1.2 Thành phần hóa học Bảng 3.2: Thành phần các chất có trong 100g táo [25] Thành phần Hàm lượng/100g Thành phần Hàm lượng/100g Nước 85,56g Sắt 0,12ng Protein 0,26g Magie 5,0ng Lipids 0,17g Photpho 11,0mg Tro 0,19g Kali 107mg Carbohydrate 13,81g Natri 1,0mg Sucrose 10,39g Kẽm 0,04mg Glucose 2,07g Vitamin C 4,60mg
Fructose 2,43g Vitamin A 54,0UI
Tinh bột 0,05g Cholesterol 0,0mg
Dietary Fiber 2,40g Calo 52,0Kcal
28
Táo chứa khoảng 85% nước, 12-14% carbohydrate, khoảng 0,3% protein, chất béo < 0,1%, chất khoáng và vitamin. Thành phần này còn thay đổi tùy theo giống, vị trí trồng trọt, điều kiện khí hậu, thời điểm thu hoạch. [25]
Mùi thơm và vị ngon của từng loại táo rất khác nhau, còn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu trồng trọt, các biến đổi, chuyển hóa trong quá trình chín, bảo quản,…Các chất tạo mùi có trong trái táo chủ yếu là ethyl acetate, ethyl propionate, propyl acetate , 2-methyl butyl acetate, butyl isomyl, hexyl hexanoates,…
3.5.1.3 Cấu tạo tế bào thịt quả
Trong các thành phần của trái táo đã kể trên thì carbohydrate đóng vai trò là quan trọng, chiếm khoảng 15% hàm lượng chất khô, gồm tinh bột, các loại đường, pectin, cellulose và hemicelluloses. Khoảng 80% lượng carbohydrate trong trái táo là đường sucrose (khoảng 2%), glucose (2,4%), và fructose ( 6,0%). Tổng chất xơ khoảng 2%, và 0,2% sorbitol có trong nước táo. Hàm lượng acid malic có trong táo là 0,3-1,0% [26]. Còn pectin chiếm khoảng 0,5- 1,6% [13]. Các hàm lượng này khác nhau tùy thuộc vào giống táo.
Hình 3.3: Cấu tạo thịt quả [30]
Thành tế bào của trái táo gồm có các thành phần sau: bộ khung cellulose và hemicelluloses được bao bọc bởi pectin. Chúng được mô tả bởi mô hình của Carpital và Gibeaut: thành tế bào thực vật gồm 3 cấu trúc chính độc lập nhưng tương tác lẫn nhau. Cấu trúc 1: bộ khung cellulose và xyloglucan (chiếm 50% trọng lượng khô) được bao bọc xung quanh bởi lớp cấu trúc thứ 2 là polysaccharide peptin (chiếm 25-40% trọng lượng khô. Cấu trúc 3 là cấu trúc độc lập của protein
29 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(extension_chiếm khoảng 1%). Đối với thành của trái táo, chủ yếu là cellulose chiếm 25-30% trọng lượng khô), pectin chiếm 25-30% và fucogalactoxyloglucan chiếm 15-20%, còn protein ước tính khoảng < 2%. [9, 10]
Cellulose:
Cellulose là một polymer mạch thẳng, gồm nhiều phân tử đường D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucosid. Liên kết glucoside giúp sợi khó cắt, và vì phân tử glucose định hướng thành dạng trans với phân tử glucose bên cạnh nên không tạo liên kết với nước, không tan trong nước.
Ngoài ra có sự hình thành liên kết hydro nội phân tử, làm cellulose cứng và dai. Và chính liên kết hydro giữa các mạch cellulose cạnh nhau giúp định hình thành bó sợi song song.
Hình 3.4: Cấu trúc cellulose trong thịt quả [31]
Cấu trúc cellulose không đồng nhất nên tồn tại vùng vô định hình và vùng kết tinh. Vùng vô định hình ít hơn vùng kết tinh. Vùng kết tinh có trật tự cao, khó bị phá hủy bởi enzym cellulase, hóa chất dung môi, đây là vùng mà các vi sợi được định hướng. Vùng vô định hình thì cấu trúc hỗn độn, nằm lẫn với vùng kết tinh, dễ bị thủy phân.
Các vi sợi trong tế bào tập trung thành phiến mỏng, giữ các vi sợi là lignin và glycan liên kết ngang với nhau gọi là hemicellulose.
30 Hemicelluloses:
Là một polusaccharide có thể tan trong kiềm và acid. Công thức phân tử (C5H8O4)n , có cấu tạo phức tạp do 50 – 200 phân tử đường tạo nên. Các đường tạo nên hemicellulose là pentose (arabinose, xylose), hexose (galactose, glucose, mannose). Trong đó nhiều nhất là xylose. Xylan được cấu tạo từ D – glucose liên kết với nhau bằng liên kết β – 1,4 glycoside.
Hemicellulose là một polymer phân nhánh với cấu trúc ngẫu nhiên, vô định hình. Mạch nhánh có cấu trúc đơn giản là disaccharide hoặc trisaccharide. Hemicellulose liên kết với các polysaccharide khác và lignin nhờ các nhánh này.
Hình 3.5: Cấu trúc của hemicelluloses [32]
Pectin:
Pectin là một polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực vật. Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2 dạng là pectin hòa tan và protopectin không hòa tan. Dưới tác dụng của acid, enzyme protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin.
Pectin là hợp chất cao phân tử polygalactoronic có đơn phân tử là galactoronic và rượu metylic. Trọng lượng phân tử từ 20.000 - 200.000 đvC. Hàm lượng pectin 1% trong dung dịch có độ nhớt cao, nếu bổ sung 60 % đường và điều chỉnh pH môi trường từ 3,1-3,4 sản phẩm sẽ tạo đông.
Cấu tạo phân tử pectin là một dẫn suất của acid pectic, acid pectic là một polymer của acid D-galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết 1-4-glycozide.
31
Hình 3.6: Cấu tạo pectin [33]
3.5.2 Phương pháp cố định trên táo
Sử dụng tế bào cố định trong lên men rượu là lãnh vực nghiên cứu hấp dẫn, và được mở rộng nhanh chóng bởi kỹ thuật dễ và những ưu điểm về kinh tế so sánh với sử dụng tế bào tự do. Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp sản xuất rượu, vấn đề nghiên cứu tế bào cố định cần phải tiến hành trên các chất mang an toàn trong thực phẩm, rẻ, có sẳn trong tự nhiên, thích hợp cho quá trình lên men nhiệt độ thấp và cải thiện được mùi vị của sản phẩm. Trong sản xuất rượu, quá trình lên men ở nhiệt độ thấp cho chất lượng sản phẩm cao hơn. Nhiều nghiên cứu đã đề nghị nhiều chất mang cho tế bào cố định trong công nghiệp sản xuất rượu. Tuy nhiên, những chất mang này không thuận tiện trong sản xuất rượu bởi chúng là các vật liệu vô cơ. Alginate và cellulose là các chất mang thay thế mới, được cho là hữu hiệu cho quá trình lên men cồn nhiệt độ thấp.
Rượu táo được sản xuất từ nước ép táo. Loại thức uống này có hương vị thơm ngon. Do đó, việc ứng dụng táo làm chất mang cố định rất có tiềm năng. Đây là chất mang an toàn trong thực phẩm, có sẵn trong tự nhiên, sản lượng táo hằng năm rất lớn, do đó việc sử dung táo như là một chất mang cố định sẽ tạo ra các sản phẩm có mùi vị ngon do có sự tách các cấu tử thơm trong táo vào rượu.
Một số nghiên cứu về việc cố định nấm men trong sản xuất rượu vang đã tiến hành trong những năm gần đây. Và đưa ra phương pháp cố định như sau:
Chuẩn bị nấm men
Nấm men Saccharomyces cerevisiae thuần chủng sau khi được phân lập được nuôi trong môi trường: 4% glucose, 0,1% (NH4)2SO4, 0,15% KH2PO4 và 0,5% MgSO4. Sau đó ly tâm thu sinh khối nấm men. [20s]
32 Chuẩn bị chất mang
Để cố định tế bào vi sinh vật với chất mang là táo, đầu tiên táo sẽ được cắt