CHƯƠNG 3 QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALOLACTIC
3.2 CÁC BIẾN ĐỔI DIỄN RA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALOLACTIC 1 Các biến đổi sinh học
3.2.1 Các biến đổi sinh học
3.2.1.1 Sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic
1- Sự hiện diện của loại vi khuẩn malolactic khác nhau trong dịch lên men chính
Trong hỗn hợp dịch nho trước khi lên men cĩ chứa rất nhiều lồi vi khuẩn lactic khác nhau. Sau quá trình lên men chính (nồng độ ethanol đạt 13%) thì hầu như chỉ cịn Oenococcus oeni
phát triển với số lượng khoảng 106 cfu/mL (xem bảng 2.6). Như vậy, O. oeni là vi khuẩn thích hợp để thực hiện quá trình lên men malolactic hơn cả. Vi khuẩn này cĩ khả năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt của mơi trường lên men.
2- Sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic với các phương pháp lên men khác nhau
Trong trường hợp quá trình lên men malolactic xảy ra một cách tự phát (khơng thực hiện việc cấy giống vi khuẩn malolactic vào dịch lên men rượu vang hay dịch nho), vi khuẩn malolactic cĩ sẵn trong nho hay thiết bị lên men sẽ phát triển sau quá trình lên men chính (tức trong giai đoạn tàng trữ vang). Sự sinh trưởng và phát triển của chúng trong điều kiện trên cĩ những thuận lợi là trong dịch vang lúc này cĩ chứa một số hợp chất được giải phĩng từ quá trình tự phân của xác nấm men. Các chất này cĩ tác dụng kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic. Vì vậy, trong nghề làm rượu vang từ lâu người ta đã giữ quan điểm cho rằng tàng trữ vang trên xác nấm men men hay bổ sung các sản phẩm từ quá trình tự phân của nấm men sẽ làm tăng chất lượng vang thành phẩm. Tuy nhiên, cĩ một số nhà nghiên cứu lại cho rằng chính những hợp chất từ quá trình tự phân xác nấm men cũng tạo điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn khơng mong muốn phát triển và là nguyên nhân làm giảm chất lượng rượu vang. Bên cạnh đĩ, việc lên men malolactic bởi một số lồi vi khuẩn lactic cĩ sẵn trong nguyên liệu cũng cĩ thể gặp khĩ khăn do phần lớn các vi khuẩn này khơng chịu được nồng độ ethanol cao sau quá trình lên men chính. Do đĩ, quá trình lên men malolactic hoặc khơng diễn ra hoặc sẽ diễn ra rất chậm và kéo dài. Từ những nhược điểm kể trên, người ta thấy rằng nếu thực hiện quá trình lên men malolactic bằng phương pháp lên men tự nhiên sẽ dẫn đến hệ quả là quá trình lên men rất khĩ kiểm sốt và chất lượng sản phẩm sẽ khơng ổn định.
Trong cơng nghiệp sản xuất rượu vang hiện nay, người ta áp dụng phương pháp lên men cĩ kiểm sốt bằng cách cấy canh trường vi khuẩn malolactic thuần khiết vào dịch vang sau khi kết
thúc quá trình lên men chính hoặc cấy hỗn hợp nấm men và vi khuẩn malolactic trước khi bắt đầu quá trình lên men ethanol. Ưu điểm của các phương pháp này là rút ngắn thời gian lên men malolactic, từ đĩ làm rút ngắn thời gian lên men phụ, đồng thời mang lại chất lượng rượu vang tốt hơn và ổn định hơn.
Trong trường hợp cấy giống vi khuẩn malolactic cùng với nấm men (xem hình 3.9b) người ta tiến hành như sau: cấy giống (hỗn hợp nấm men và vi khuẩn) vào dịch nho và cho lên men rượu ở nhiệt độ 25oC và pH ban đầu là 4,8. Ở tất cả các mẫu thử nghiệm đều thấy rằng, số lượng tế bào vi khuẩn malolactic được đưa vào vang đều giảm nhanh ở những giờ đầu và sau 48 giờ lên men thì trong vang cĩ tới 25-90% số tế bào mất khả năng sinh sản. Tuy nhiên, từ ngày lên men thứ 15 đến ngày thứ 30, chúng bắt đầu ổn định, thích ứng dần với mơi trường và sinh trưởng. Như vậy, thời gian cần thiết để vi khuẩn malolactic thích ứng được với mơi trường vang cĩ thể kéo dài từ 8 đến 30 ngày.
Trong trường hợp cấy giống vi khuẩn malolactic (được tái hoạt hĩa trước) vào canh trường sau lên men ethanol thì vi khuẩn lactic cĩ thể sinh trưởng và phát triển nhanh hơn. Từ đĩ, thời gian lên men cĩ thể được rút ngắn hơn.
3- Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn malolactic
Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn malolactic trong mơi trường vang bao gồm 4 pha:
Pha thích nghi (pha lag): trong trường hợp lên men cĩ cấy giống vi khuẩn malolactic từ bên ngồi vào, pha lag tương đương với giai đoạn vi khuẩn malolactic thích nghi với mơi trường. Vận tốc sinh trưởng trong giai đoạn này coi như bằng khơng. Số lượng tế bào vi khuẩn malolactic lúc này khơng tăng nhưng sự trao đổi chất của chúng lại diễn ra mạnh mẽ. Hàm lượng các nucleotide, protein, đặc biệt là các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất được tổng hợp với tốc độ rất nhanh. Song, điều khơng thuận lợi xảy ra trong giai đoạn này là chất dinh dưỡng trong dịch lên men hầu như đã được nấm men sử dụng gần hết, đồng thời nấm men lại giải phĩng ra ethanol gây ức chế và kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn malolactic. Vì vậy nếu muốn pha thích nghi xảy ra nhanh thì ta phải cấy vào mơi trường lên men một lượng giống lớn bao gồm các tế bào trẻ, khỏe và cĩ khả năng thích nghi cao.
Pha sinh trưởng lũy thừa (pha log): trong pha này hầu hết các vi khuẩn malolactic đã qua pha thích nghi sẽ sinh trưởng với tốc độ sinh trưởng là cực đại. Số lượng tế bào sẽ tăng theo quy luật cấp số nhân. Tất cả các chất dinh dưỡng trong mơi trường được vi khuẩn sử dụng chỉ nhằm
TÀNG TRỮ LÊN MEN MALOLACTIC LÊN MEN ETHANOL XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU Nấm men (a) (b) (c) Nấm men Bổ sung chế phẩm vi khuẩn malolactic LÊN MEN
ETHANOL MALOLACTICLÊN MEN TÀNG TRỮ XỬ LÝ
NGUYÊN LIỆU
Hình 3.9 Sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và các vi sinh vật khác trong rượu vang lên men malolactic tự nhiên (a) và lên men malolactic cĩ kiểm sốt: cấy giống trước (b) và sau (c)
vào mục đích chính là xây dựng vật chất tế bào và sinh sản. Khi đĩ các chất dinh dưỡng sẽ từ từ giảm đi và xuất hiện một số sản phẩm trao đổi chất khơng cần thiết cĩ khả năng gây ức chế tế bào. Như vậy, các điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng dần dần bị mất đi và bắt đầu chuyển sang pha ổn định.
Pha ổn định: trong pha này số lượng tế bào sống là ổn định và mật độ quần thể là tối đa. Acid malic hầu như được phân giải hồn tồn, các chất dinh dưỡng khác (cịn rất ít) cũng được vi khuẩn tiếp tục sử dụng.
Pha suy vong: trong pha này các tế bào sống bắt đầu già đi, giảm dần và tế bào chết tăng dần, xuất hiện hiện tượng tự phân do các enzyme protease nội bào.
3.2.1.2. Sự sinh trưởng và trao đổi chất của nấm men
Trong giai đoạn tiến hành lên men malolactic, tác nhân vi sinh vật chính là vi khuẩn malolactic. Sự hiện diện của nấm men khơng đĩng vai trị rõ rệt vì trong giai đoạn này hầu như nấm men khơng sinh trưởng hoặc sinh trưởng rất yếu và bước vào pha suy vong nhường chỗ cho vi khuẩn malolactic phát triển. Một phần nấm men chết đi cĩ thể bị tự phân. Hiện tượng tự phân của nấm men là hiện tượng các thành phần của xác tế bào nấm men bị phân giải dưới tác dụng của enzyme thủy phân (hydrolase) của chính bản thân tế bào. Trong quá trình này, hầu hết các protein, carbohydrate, acid nucleic, lipid và các vật chất của tế bào đều bị phân giải thành những chất cĩ phân tử lượng thấp hơn và hịa tan vào mơi trường. Điều kiện để hiện tượng tự phân tế bào xảy ra là tế bào đã chết nhưng vẫn cịn giữ được hoạt tính của các enzyme hydrolase. Trong sản xuất rượu vang truyền thống, người ta cĩ thể tận dụng xác nấm men tự phân làm nguồn cung cấp một số chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn lên men malolactic phát triển.
3.2.1.3. Tương tác sinh học giữa nấm men và vi khuẩn malolactic
Sự tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic cĩ ý nghĩa quan trọng trong sản xuất rượu vang. Bên cạnh việc nghiên cứu tuyển chọn những giống vi khuẩn malolactic cĩ khả năng thích nghi cao và lên men malolactic tốt, người ta cịn nghiên cứu những tương tác cĩ lợi giữa nấm men và vi khuẩn nhằm mục đích tăng cường khả năng chống chịu của vi khuẩn trước những ảnh hưởng bất lợi của mơi trường. Trong vài thập kỷ qua, đã cĩ khá nhiều nghiên cứu của các tác giả xoay quanh vấn đề tương tác sinh học giữa nấm men và vi khuẩn malolactic (Fornachon, 1968; Beelman và cộng sự, 1982; Lemaresquier, 1987; Lonvaud-Funel và cộng sự,
1988a,b; Henschke, 1993; Henick-Kling và Park, 1994). Tất cả những nghiên nghiên cứu này đều đã chỉ ra được các loại tương tác khác nhau (kích thích, kìm hãm và trung lập) giữa vi khuẩn malolactic và nấm men.
Mức độ của những tương tác này cịn tùy thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm sự tương tác của từng tổ hợp chủng nấm men/vi khuẩn malolactic cụ thể (xem hình 3.6), sự hấp thu và giải phĩng các các chất dinh dưỡng bởi nấm men, sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào cĩ khả năng hoặc kích thích hoặc gây độc đối với vi khuẩn malolactic (Beelman và cộng sự, 1982; Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988a; Henschke và Jiranek, 1993).
Các chủng vi khuẩn malolactic sử dụng
Hình 3.10 Giản đồ biểu diễn các kiểu tương tác khác nhau (kích thích , kìm hãm , khơng tương tác ) giữa 77 chủng nấm men và 3 chủng vi khuẩn thuộc lồi Oenococcusoeni: CHR,
BR 16-97 và DBVPG 8903.
Nhìn chung, khi xét ảnh hưởng tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic ta thường đề cập đến 2 vấn đề:
1- Nhiều chủng nấm men cĩ khả năng gây nên những tác động kích thích hoặc kìm hãm đến sự sinh trưởng và khả năng lên men vi khuẩn malolactic
Ức chế vi khuẩn malolactic bởi nấm men
Cơ chế tương tác mang tính chất ức chế của nấm men đến vi khuẩn malolactic vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng. Nhưng nhìn chung những tác động này đều cĩ liên quan đến sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào của nấm men như ethanol, SO2, các acid béo mạch trung bình và protein (chất kháng khuẩn tự nhiên):
Ethanol cĩ khả năng ức chế các vi khuẩn nĩi chung kể cả vi khuẩn malolactic. Người ta thấy rằng đối với vi khuẩn malolactic, ethanol tác dụng mạnh mẽ lên sự sinh trưởng nhưng ít ảnh hưởng đến khả năng lên men malolactic của vi khuẩn này. Theo các tác giả (Capucho và San Romao 1994), ở nồng độ 4% (v/v), ethanol đã cĩ thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic nhưng khả năng phân giải acid malic của vi khuẩn này vẫn đạt được 95%. SO2 sinh ra từ nấm men cĩ thể phối hợp cùng với SO2 được cho vào từ quá trình sulphite
hĩa dịch nho ban đầu là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự ức chế vi khuẩn malolactic và kéo dài thời gian lên men. Người ta thấy rằng, hầu hết các chủng nấm men cĩ khả năng tổng hợp được SO2 với hàm lượng lên đến 30 mg/L, một số ít cĩ thể cĩ thể sinh ra SO2 nhiều hơn, thậm chí hơn 100 mg/L (Rankine và Pocock, 1969; Eschenbruch, 1974; Dott và cộng sự, 1976; Suzzi và cộng sự, 1985).
Các acid béo mạch trung bình như acid decanoic, dodecanoic, hexanoic, octanoic... cũng cĩ khả năng ức chế sinh trưởng và khả năng lên men malolactic vi khuẩn lactic, cụ thể: Acid decanoic cĩ khả năng ức chế cả nấm men lẫn vi khuẩn malolactic (Edwards và
Beelman, 1987; Edwards và cộng sự, 1990; Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988).
Đối với hỗn hợp acid decanoic và dodecanoic, Capucho và San Romao (1994) đã chứng minh rằng, hàm lượng thấp của các acid này (12,5 mg/L decanoic và 2,5 mg/L dodecanoic) kích thích khả năng lên men malolactic của vi khuẩn nhưng ở hàm lượng cao hơn thì xảy ra theo chiều hướng ngược lại.
Sự cĩ mặt đồng thời của các acid hexanoic, octanoic và decanoic cĩ thể gây tác động ức chế đến sinh trưởng và lên men malolactic mạnh hơn so với khi chỉ tồn tại riêng lẻ từng loại acid béo (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988).
Sự tạo thành các hợp chất cĩ hoạt tính kháng khuẩn cũng đã được nghiên cứu. Theo tác giả Dick và cộng sự (1992), các hợp chất này cĩ bản chất là protein tích điện âm (cationic protein). Tuy nhiên khả năng này cũng phụ thuộc vào từng chủng và cĩ ít những nghiên cứu sâu về lĩnh vực này đối với các chủng nấm men khác nhau trong sản xuất rượu vang (H. Alexandre và cộng sự, 2004).
Bên cạnh khả năng ức chế bởi các chất cĩ hoạt tính sinh học và các chất kháng khuẩn tự nhiên, sự ức chế vi khuẩn malolactic bởi nấm men cịn do sự cạn kiệt về nguồn chất dinh dưỡng. Các chất này được nấm men sử dụng trong giai đoạn sinh trưởng và lên men ethanol. Kết quả là sau khi kết thúc quá trình lên men ethanol và bắt đầu lên men malolactic, các chất sinh trưởng như amino acid, vitamin hầu như khơng cịn đủ cho vi khuẩn malolactic phát triển.
Kích thích vi khuẩn malolactic sinh trưởng bởi nấm men
So với tác động ức chế của nấm men, tác động kích thích lên vi khuẩn malolactic ít được nghiên cứu hơn. Tuy nhiên, theo Fornachon (1968), sự tăng cường hay kích thích khả năng lên men malolactic của vi khuẩn cĩ liên quan đến hiện tượng tự phân của nấm men. Khi nấm men tự phân sẽ giải phĩng vào dịch lên men một lượng các hợp chất nitơ và vitamin. Các hợp chất này rất cần thiết cho sự sinh trưởng và trao đổi chất của của vi khuẩn malolactic trong vang, cụ thể:
Các phân đoạn nitơ khác nhau đối với sinh trưởng vi khuẩn malolactic
Hiện nay vẫn chưa cĩ một kết luận chính thức nào về khả năng sử dụng và chuyển hĩa các loại peptide ở các vi khuẩn malolactic. Tuy nhiên, đã cĩ nhiều nghiên cứu cho thấy sự ảnh hưởng của các phân đoạn protein từ dịch tự phân nấm men trong mơi trường vang đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic. Các nghiên cứu trên đều cho thấy, khi sử dụng hỗn hợp các phân đoạn nitơ khác nhau gồm các phân đoạn cĩ phân tử lượng lần lượt là <0,5; 0,5-1,0; 1-10; >10 kDa thì các acid amin tự do và đoạn peptide cĩ phân tử lượng <1 kDa cĩ tác dụng kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn rất tốt so với các phân đoạn cĩ phân tử lượng lớn hơn gồm các đại phân tử >10 kDa và các đoạn peptide 1-10 kDa (Feuillat và cộng sự 1977; Guilloux-Benatier và Chassagne, 2003).
Vai trị của hợp chất nitơ cao phân tử đối với hoạt tính enzyme thủy phân protein của vi khuẩn malolactic
Nghiên cứu của tác giả Lonvaud-Funel và cộng sự (1988) lại cho thấy rằng các phân đoạn protein cĩ phân tử lượng >12 kDa cũng đĩng vai trị như một chất cảm ứng và gĩp phần quan trọng trong việc làm tăng hoạt tính các enzyme exoprotease của vi khuẩn malolactic. Trên cơ sở đĩ, nghiên cứu của Guilloux-Benatier (1993, 1995) đã cho thấy ảnh hưởng của các hợp chất cao phân tử sinh ra từ quá trình tự phân của nấm men đối với sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic. Những chất này bao gồm các polysaccharide thành tế bào và các phân tử protein. Việc bổ sung các hợp chất cao phân tử từ dịch chiết nấm men vào canh trường lên men malolactic cĩ khả năng kích thích hoạt tính các enzyme aminopeptidase ở O. oeni. Do vậy, lồi vi khuẩn này cĩ thể thủy phân được các phân đoạn nitơ cao phân tử cĩ trong vang ở cuối giai đoạn lên men chính. Nhờ đĩ, nĩ gĩp phần giúp rút ngắn pha thích nghi và làm tăng tốc độ tổng hợp sinh khối của vi khuẩn malolactic.
Một số tác giả khác (Farías và Manca de Nadra, 2000) cũng đã làm sáng tỏ khả năng phân giải các phân đoạn protein ở vi khuẩn O. oeni. Kết quả nghiên cứu cho thấy, O. oeni cĩ khả năng làm tăng hàm lượng các amino acid và peptide trong dịch lên men rượu vang (Manca de Nadra và cộng sự, 1999).
Vai trị của mannoprotein
Mannoprotein là thành phần chính được giải phĩng ra từ nấm men tự phân. Cũng giống như các hợp chất cao phân tử khác, mannoprotein cũng ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic (Guilloux-Benatier và cộng sự, 1995). Vai trị của manoprotein cĩ thể được giải thích bởi 2 cơ chế:
Cơ chế thứ nhất liên quan đến khả năng hấp phụ các acid béo mạch trung bình tổng