2.1.3.1 Vi khuẩn lên men malolactic trong tự nhiên
Trong nghề làm rượu vang truyền thống, quá trình lên men malolactic xảy ra hồn tồn tự phát bởi một số vi khuẩn lactic cĩ sẵn trong nho và thiết bị làm rượu. Khi đĩ, trong quá trình lên men rượu sẽ cĩ sự phát triển đồng thời của cả nấm men và vi khuẩn; và trong một mơi trường sống cạnh tranh như vậy, lồi nào cĩ khả năng phát triển (về số lượng) một cách vượt trội hơn thì sẽ chiếm ưu thế. Một điều đáng lưu ý ở đây là trước khi lên men người ta thường sulfite hĩa phần thịt và vỏ nho nên sự phát triển của vi khuẩn chỉ cĩ thể diễn ra chủ yếu sau quá trình lên men chính (lên men ethanol) kết thúc, lúc đĩ hàm lượng đường cịn lại là rất ít, chúng sẽ sử dụng acid malic như là nguồn carbon chính để sinh trưởng và phát triển.
Bảng 2.6 Danh sách liệt kê các vi khuẩn lactic khác nhau hiện diện trong dịch nho trước và sau khi lên men ethanol (cfu/ml) (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1991)
Chú thích: KXĐ: khơng xác định 1- Leuconostoc và Oenococcus
Trong nhiều trường hợp, các vi khuẩn lactic lên men dị hình hình cầu là tác nhân lên men malolactic nhiều hơn cả. Người ta tìm thấy cĩ một lồi thuộc giống Leuconostoc thường gặp nhất trong dịch nho làø Leuconostoc mensenteroides. Một lồi khác thuộc giống Oenococcus chỉ xuất hiện với số lượng rất ít trong dịch nho nhưng cĩ thể sinh trưởng rất tốt và chiếm số lượng vượt trội so với những lồi khác sau quá trình lên men ethanol (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1991). Đĩ là Oenococcusoeni.
Theo E.Peymand, khi khảo sát 398 chủng nghiên cứu của giống Leuconostoc và
Oenococcus ở pH 3,0 đã thu được 36% số chủng lên men acid malic và cĩ 7% số chủng lên men đường; ở pH 3,2 chỉ cĩ 31% số chủng lên men acid malic và 12% số chủng lên men đường. Ở
pH cao hơn số chủng lên men đường nhiều hơn và lên men acid malic ít hơn. Điều này chứng tỏ rằng, các cầu khuẩn lên men lactic dị hình sinh trưởng được trong mơi trường pH càng thấp thì sẽ càng chuyển hĩa tốt acid malic. Ngồi ra, cũng theo tác giả này, những chủng khơng lên men acid citric và đường arabinose cũng là tác nhân lên men malolactic đáp ứng được mong muốn. Điều quan trọng là trong lên men malolactic vi khuẩn này sử sụng acid malic là cơ chất chính, chúng cũng cĩ thể lên men một phần glucose và khơng sinh ra các acid bay hơi.
Trong số các cầu khuẩn này người ta tìm được một lồi mang tên Oenococcus oeni. Đây là lồi cĩ khả năng chịu pH thấp nhất và cĩ thể phân giải hồn tồn acid malic trước khi sử dụng đường.
2- Lactobacillus
Thuộc giống này cĩ các lồi thường cĩ mặt và chiếm số lượng đáng kể trong dịch nho nguyên liệu như Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. hilgardii, Lb. brevis. Do sinh trưởng yếu trong mơi trường vang (bị tác động mạnh của pH, ethanol và SO2) nên các lồi này cĩ khuynh hướng giảm dần và lần lượt bị ức chế sau quá trình lên men ethanol.
Các trực khuẩn lên men lactic dị hình thuộc giống Lactobacillus cĩ trong dịch lên men hay trong vang khơ đều cĩ thể tạo thành một lượng khá lớn acid bay hơi. Do vậy, chúng là những lồi khơng mong muốn trong sản xuất rượu vang.
3- Pediococcus
Các vi khuẩn lên men đồng hình thuộc giống Pediococcus cĩ khả năng phân giải acid malic đồng thời với lên men đường glucose cịn sĩt lại trong vang khơ tạo thành một lượng acid lactic mà khơng sinh ra sản phẩm phụ.
Các lồi Pediococcus thường gặp trong dịch nho là P. cerevisiae, P. pentosaceus, P. damosus. Cũng như Lactobacillus chúng hầu như biến mất sau quá trình lên men ethanol. 2.1.3.2 Vi khuẩn lên men malolactic trong cơng nghiệp
1- Các dạng chế phẩm vi khuẩn malolactic trong cơng nghiệp
Trong sản xuất, người ta thấy rằng cĩ vài lồi vi khuẩn thuộc giống Pediococcus và
Oenoccocus oeni hay Leuconostoc oenos, là lồi vi khuẩn lactic cĩ lợi thường xuất hiện nhiều nhất. Chúng cĩ khả năng thích nghi cao và phát triển rất tốt trong mơi trường này nên thường được các nhà sản xuất lựa chọn để tiến hành lên men ML (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1991).
Từ những năm đầu 1980, nhiều nhà sản xuất giống vi khuẩn lactic rượu vang đã cho ra đời các chế phẩm giống vi khuẩn malolactic dạng canh trường bao gồm các chủng thuộc các lồi
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus hilgadii, Oenococcus oeni. Các chế phẩm này cĩ thể được sản xuất dưới dạng một canh trường chứa một chủng hay hỗn hợp nhiều chủng khác nhau.
Ưu điểm của việc ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật trong sản xuất rượu vang là giúp kiểm sốt được tốt hơn thời gian và mức độ lên men malolactic, đồng thời quá trình này khơng đơn giản chỉ với mục đích làm giảm độ chua gắt của rượu vang thành phẩm mà cịn mang lại nhiều lợi ích khác cho chất lượng rượu vang. Điều này đã được trình bày ở phần 1.3.1.
Các chế phẩm canh trường thường sản xuất dưới 2 dạng: dạng sử dụng ngay (fresh starter culture) hay dạng sấy thăng hoa (freeze-dried preparation). Tuy nhiên, đứng về mặt thương mại chế phẩm dạng sấy thăng hoa thường được ưa thích hơn. Nguyên nhân là dạng fresh thường phải được làm ra và bán trực tiếp tại các cơ sở sản xuất rượu vang đặt ở vùng trồng nho (winegrowing regions) cịn đối với dạng sấy thăng hoa thì linh động hơn và chất lượng ổn định hơn. Tuy nhiên, dạng này cĩ nhược điểm là chi phí năng lượng cho sản xuất và bảo quản chế phẩm cao hơn.
2- Sản xuất canh trường giống Oenococcus oeni (Production of starter culture)
Tuyển chọn giống dựa trên các tiêu chí được nêu trong phần 2.2. Quá trình nhân giống cĩ thể được thực hiện theo các phương pháp lên men theo chu kỳ, lên men bán liên tục và lên men liên tục cĩ hoặc khơng cĩ hồi lưu tế bào. Mỗi phương pháp lên men đều cĩ những ưu và nhược điểm khác nhau ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất của thiết bị và hoạt tính sinh lý của tế bào giống.
Thơng thường quá trình sấy thăng hoa các sản phẩm nĩi chung luơn được cho là giải pháp khơng mang lại tính kinh tế cho nhà sản xuất do trang thiết bị đắt tiền, chi phí năng lượng cao... Nhưng trong lĩnh vực ứng dụng này, nĩ được đánh giá cao bởi các ưu điểm: khả năng trữ rất lâu, dễ sử dụng và phân phối. Hơn nữa, hoạt tính vi khuẩn sau sấy thăng hoa cũng ít bị biến đổi trong một khoảng thời gian nhất định tùy vào điều kiện bảo quản.
Thơng thường, trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ -15oC, khơng cĩ O2 và ẩm thì hoạt tính của chế phẩm cĩ thể được đảm bảo trong vịng 8 tháng (Gewurzmuller, Stuttgart). Tuy nhiên, ta cũng cĩ thể đưa chế phẩm ra ngồi ở nhiệt độ 20o trong vài ngày và sau đĩ tiếp tục lặp lại điều kiện bảo quản lạnh đơng thì hoạt tính giống cũng khơng bị ảnh hưởng đáng kể. Theo cách này các chế phẩm dạng sấy thăng hoa cĩ thể được vận chuyển và phân phối trong điều kiện khơng cần lạnh.
Hình 2.12 Sơ đồ khối quy trình sản xuất canh trường giống sấy phun 3- Sử dụng chế phẩm
Việc đưa giống vi khuẩn thuần chủng vào dịch lên men để tiến hành lên men malolactic là tương đối khĩ khăn bởi vì trong dịch lên men, các thành phần dinh dưỡng cho vi khuẩn phát
triển rất hạn chế. Bên cạnh đĩ, ở một số vang cần lên men cĩ pH thấp, hàm lượng cồn và SO2 cao cũng cĩ thể kìm hãm vi khuẩn phát triển.
Vì vậy, vấn đề đặt ra đầu tiên khi sử dụng chế phẩm là phải tái hoạt hĩa vi khuẩn malolactic trước khi cấy vào dịch lên men. Sơ đồ hình 2.13 giới thiệu quy trình tái hoạt hĩa canh trường giống sấy thăng hoa để chuẩn bị cho quá trình lên men malolactic.
Hình 2.13 Quy trình tái hoạt hĩa chế phẩm trước khi tiến hành lên men malolactic 4- Lựa chọn chế phẩm canh trường giống thuần khiết vào lên men malolactic
Bảng 2.7 Một số điều kiện lên men cần cho việc lựa chọn loại chế phẩm canh trường giống Loại vang Thơng số Điều kiện giới hạn Điều kiện thường Điều kiện lý tưởng
Nhiệt độ <15oC 16-18oC >18oC pH <3,1 3,2 3,2 Ethanol 13,5% 12,5-13,5% <12,5% Vang trắng SO2 tổng >30 ppm 15-30 ppm Khơng cĩ SO2 Nhiệt độ <15oC 16-18oC >18oC pH <3,1 3,1 >3,1 Ethanol 14% 13-14% <13% Vang đỏ SO2 tổng >30ppm 15-30ppm Khơng cĩ SO2 Thời điểm cấy giống Trong giai đoạn lên
men ethanol
Cuối giai đoạn lên men ethanol
Sau giai đoạn lên men ethanol (vang cịn đục) Ghi chú: các điều kiện nêu trên thường được nhà sản xuất giống ghi chi tiết trên trên bao bì.
Ngày nay, các chế phẩm canh trường giống vi khuẩn lên men malolactic đã rất phổ biến và thơng dụng. Hầu hết chúng đều thuộc lồi O. oeni cĩ hoạt tính lên men malolactic cao, chống chịu tốt với mơi trường pH thấp và nồng độ ethanol cao. Tuy nhiên, việc lựa chọn một chế phẩm canh trường phù hợp cho quy trình sản xuất rượu vang cũng hết sức quan trọng. Do đĩ nhà sản xuất cần nghiên cứu kỹ về thành phần dịch lên men (ethanol, SO2, pH) và điều kiện lên men trước khi chọn chế phẩm (xem bảng 2.7).
2.2 YÊU CẦU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC TRONG SẢN XUẤT Ngày nay, người ta đã dùng vi khuẩn lactic thích hợp (ví dụ Oenococcus oeni) được nhân