C ản trở sự nhân lên của virut trong tế bào
5 Chọn lọc dựa vào chỉ thị (Marker-assisted selection)
Giám ựịnh chắnh xác các giống, dòng và nguồn vật liệu khởi ựầu cho chọn giống cực kỳ quan trọng ựối với việc chọn lọc bố mẹ ựể tạo ra nguồn biến dị di truyền. Vắ dụ, quan hệ họ hàng là một yếu tố xác ựịnh việc chọn bố mẹở cả cây tự thụ phấn lẫn cây giao phấn. Tạo giống dòng thuần thường dựa vào việc sử dụng các dòng có quan hệ thân thuộc, trong khi ựó con lai tốt nhất ựược tạo thành từ tổ hợp của các bố mẹ tự phối có quan hệ xa nhau. Có thể xác ựịnh mức ựộ thân thuộc bằng cách kiểm tra gia phả, năng suất của con lai và những ựặc ựiểm hình thái. Các phương pháp xác ựịnh này thường không chắnh xác.
để tăng ựộ chắnh xác trong giám ựịnh nguồn gen, những năm gần ựây các nhà chọn giống ựã áp dụng phương pháp ựiện di isozym và tắnh ựa hình vềựộ dài của phân ựoạn hạn chế (restriction fragment length polymorphism, viết tắt là RFLP), AFLP và các kỹ thuật phân tắch genom khác. điện di enzym dựa vào việc ựịnh lượng một loạt các enzym chứa trong các mô ựặc thù, chẳng hạn trong cây ựang nảy mầm. Trong mỗi enzym có thể xác ựịnh ựược các alen khác nhau (allozym hay isozym) nhờ tắnh di ựộng khác nhau trên màng polyacrylamide gel trong một ựiện trường. Tắnh di ựộng của enzym phụ thuộc trọng lượng phân tử , ựiện tắch và cấu trúc ba chiều.
RFLP là những phân ựoạn ADN tạo ra khi ADN ựược phân giải bởi các enzym phân giải ADN gọi là enzym cắt hay enzym hạn chế ( restriction enzymes hay restriction endonuleases). Enzym hạn chế cắt ADN ở những ựiểm ựặc thù tuỳ theo trình tự bazơ. Vắ dụ enzym BAM HI cắt bất kỳ ựiểm nào của ADN có trình tự guanin-guanin-adenin- thymidin-xytosin - xytosin (GGATCC). Các phân ựoạn cắt có ựộ dài khác nhau và trọng lượng phân tử khác nhau ựược tách ra trên môi trường ựiện di. Các kiểu gen khác nhau tạo
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Giáo trình Chọn giống cây trồngẦẦẦẦ.Ầ..ẦẦẦẦẦ.129 ra một bộ RFLP khác nhau khi ựược cắt bởi cùng một enzym và ựây là cơ sởựể phân biệt các cá thể khác nhau. Cuối cùng sự khác nhau này có thể nhận biết bằng cách chuyển các phân ựoạn ADN sang màng mỏng và tiếp xúc với ựoạn mẫu ADN chỉ thị vời P32 (probe) thông qua kỹ thuật gọi là Southern blot. đoạn mẫu ADN là một ựoạn ADN mạch ựơn có trình tự biết trước dùng cho mục ựắch giám ựịnh.
Khả năng ứng dụng lớn nhất của isoym và RFLP lập bản ựồ di truyền và hỗ trợ cho chọn lọc các kiểu gen mong muốn với sự hỗ trợ của chỉ thị di truyền. Trước ựây chỉ thị hình thái ựược sử dụng ựể xây dựng bản ựồ di truyền. Chỉ thị hình thái không thể áp dụng có hiệu quả trong các chương trình chọn giống do không có cơ sở nông học, số lượng ắt, có tắnh lặn và các hiệu ứng ựa hiệu khác. Sự ra ựời của chỉ thị isozym (protein) vào giữa những năm 1970 và chỉ thị ADN từ những năm 1980 cho phép người ta ựịnh vị gen với mật ựộ cao hơn và ứng dụng hiệu quả hơn. Việc chọn lọc một tắnh trạng mục tiêu dựa vào việc phân tắch gián tiếp sự có mặt hay vắng mặt của một ựoạn nhiễm sắc thể (hay ựoạn ADN) mang gen hay alen mong muốn trên gel hay phóng xạựồ gọi là chọn lọc thông qua chỉ thị di truyền.
Chỉ thị isozym có nhiều ưu ựiểm so với chỉ thị hình thái. Kỹ thuật ựơn giản, cần một lượng vật liệu nhỏ, và có thể phân tắch nhiều mẫu ở giai ựoạn cây non. Vì thế chỉ những kiểu gen mong muốn ựược giữ lại còn những kiểu gen khác ựược ựào thải. Bản chất trội song song của isozym cho phép xác ựịnh mọi kiểu gen. Khả năng ứng dụng liên kết của chỉ thị isozym ựã ựược minh hoạở cà chua. Gen kháng tuyến trùng M1 liên kết chặt với gen Aps-1 (Acid phosphatase-1). Trong nhiều chương trình chọn tao giống cà chua người ta sàng lọc quần thể phân ly ựối với sự có mặt của alen Aps-1 (Acid phosphatase) thay cho việc ựánh giá khả năng kháng tuyến trùng. Ở lúa, gen mẫn cảm quang chu kỳ liên kết chặt và nằm giữa gen Est-2 (Esterase) và gen Pg1-2 trên nhiễm sắc thể số 6. Nhiều tắnh trạng nông học liên kết chặt với isozym ựã ựược phát hiện ở cà chua như gen Prx-2 (Peroxidase) với ms-10, gen Got-2 (Glutamate oxaloacetate transaminase) với I-3 của nấm Fusarium oxysporum.
Tuy nhiên, hạn chế của chỉ thị isozym là không ựủ ựể bao trùm toàn bộ bản ựồ nhiễm sắc thể. đểựịnh vị gen bằng một chỉ thị cần phải có liên kết rất chặt (dưới 5 cM). Từ những năm 1980 các nhà nghiên cứu ựã xây dựng bản ựồ di truyền dựa vào RFLP, AFLP hoặc ựa hình khuếch ựại ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA (RAPD) nhờ kỹ thuật phản ứng dây chuyền của polymeraza (Polymerase chain reaction, viết tắt là PCR) . Khác với isozym, chỉ thị ADN có số lượng rất lớn cho phép xây dựng bản ựồ bão hoà của toàn bộ genom. Tương tự như chỉ thị isozym, chỉ thị ADN trội song song, không bịảnh hưởng của môi trường và phân ly theo quy luật Mendel. Các tắnh trạng cần cải tiến có thể tương quan với một RFLP trong bản ựò liên kết. đặc biệt có ắch là vật liệu chỉ thị ADN cho phép xây dượng bản ựồ và ựịnh vị các locut kiểm soát các tắnh trạng số lượng.
Hiện nay bản ựồ RFLP ựã ựược thiết lập cho một số cây trồng chắnh như lúa, ngô, cà chua, khoai tây, ựậu xanh... Các bản ựồ này có thể dùng ựểựịnh vị các gen kiểm soát các tắnh trạng nông học khác nhau, gồm cả các locut kiểm soát tắnh trạng số lượng. Vắ dụở cà chua RFLP ựã ựược sử dụng ựểựịnh vị gen kháng virut khảm thuốc lá, 6 locut kiểm soát khối lượng quả, 4 locut kiểm soát hàm lượng chất rắn hoà tan, 5 lo cut kiểm soát ựộ pH của quả. định vị gen bằng RFLP giúp các nhà chọn giống gám ựịnh và mô tảựặc ựiểm của giống và chọn lọc các tắnh trạng phức tạp khó thực hiện ựược bằng các phương pháp truyền thống. Hơn nữa kỹ thuật PCR giúp nhà chọn giống xác ựịnh sự có mặt của gen có ắch rất có hiệu quả, ựặc biệt các gen kháng bệnh - những gen mà trước ựây chỉ khẳng ựịnh ựược khi có mặt của ký sinh. Một sốưu ựiểm của chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử là:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Giáo trình Chọn giống cây trồngẦẦẦẦ.Ầ..ẦẦẦẦẦ.130 6 Khả năng chọn lọc sớm từ giai ựoạn cây con ựối với những tắnh trạng biểu hiện muộn
trong ựời sống của cây, do ựó rút ngắn thời gian phải gieo trồng và ựánh giá (chất lượng quả và hạt, tắnh mẫn cảm quang chu kỳ),
6 Khả năng giám ựịnh và sàng lọc các tắnh trạng khó chọn lọc, tốn kém, hoặc tốn thời gian ựểựánh giá (khả năng kháng bệnh, khả năng chống chịu ựiều kiện bất thuận),