Ở một số loài cây dễ nuôi cấy, như khoai tây và cà chua chẳng hạn, các mẫu lá cắt rời ựược nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn trong một thời gian ngắn. Sau ựó các mẫu lá ựược ựưa vào môi trường dinh dưỡng. Trong khoảng thời gian ựó vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và xâm nhập các tế bào lá rồi tạo ra một số tế bào chuyển gen. Vì chỉ một phần nhỏ tế bào ựược chuyển nạp nên cần phải tiến hành chọn lọc. Việc chọn lọc thông thường dựa vào gen có khả năng chọn lọc, ựó là gen kháng kháng sinh hay kháng thuốc trừ cỏ. Sau ựó các mẫu lá ựược chuyển vào môi trường khác chứa một chất kháng sinh ựể diệt
Agrobacterium còn sót lại và một chất kháng sinh khác hay thuốc trừ cỏựể loại trừ các tế bào không chuyển gen.
Các tế bào ựược chọn ựược chuyển sang một loạt các các môi trường dinh dưỡng ựể tái sinh cây. Kết qủa tái sinh và tạo cây chuyển gen phụ thuộc vào loài cây. Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium ựược áp dụng rất thành công ở nhiều loài cây hai lá mầm như thuốc lá, khoai tây và cà chua.
4.2. Chuyển nạp trực tiếp
Hệ vec tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium chỉ có hiệu quả cao ở một số loài cây hai lá mầm. Các cây trồng kinh tế chắnh, ựặc biệt các loại cây cốc và nhiều loại ựậu ựỗ ắt hoặc không phù hợp với chuyển nạp thông qua Agrobacterium. Nhiều cố gắng ựã ựược tiến hành ựể phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp vào tế bào không thông qua kắ chủ trung gian.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Giáo trình Chọn giống cây trồngẦẦẦẦ.Ầ..ẦẦẦẦẦ.126 Chuyển gen thông qua Polyethylene glycol (PEG): Ban ựầu PEG ựược sử dụng trong dung hợp tế bào rồi sau ựó ựược phát triển thành kỹ thuật ựơn giản ựể chuyển nạp di truyền. PEG 6000 ở nồng ựộ 15-20% giảm thiểu tác ựộng ựẩy nhau giữa ADN và màng tế bào và bảo vệ ADN khỏi hoạt tắnh phân giải của nucleaza. PEG kắch thắch sự hấp thụ của tế bào ựối với các phần tử nhỏ tách rời như lục lạp, liposom hay vi khuẩn. Do ựó PEG làm kết tủa ADN của plasmid lên màng tế bào tạo ựiều kiện ựể ADN xâm nhập vào tế bào.
Chắch ựiện (electroinjection hay electroporation): Chắch ựiện là áp dụng xung ựiện có hiệu ựiện thế cao lên tế bào trần ựể tạo ra khe hở nhất thời ở màng tế bào làm cho các ựại bào tử như ADN có thể xâm nhập vào tế bào. Thời gian và cường ựộ xung ựiện ựược ựiều chỉnh sao cho tế bào sống sót và hấp thụ ADN một cách toả ựáng. Phương pháp này dễ lặp lại hơn so với phương pháp PEG và ựược sử dụng ựể tạo ra các tế bào và cây chuyển gen ở các loài, chẳng hạn ở lúa.
Phương pháp bắn hạt (microprojectile bombardment): Hạt vàng hay won-fram, ựường kắnh 1-4 ộm bọc ADN, ựược kết tủa với CaCl2, spermidine hoặc PEG. Hạt bọc ADN ựược tăng tốc (300-600 m/s) bằng một thiết bị ựặc biệt gọi là máy bắn hạt. Với tốc ựộ này hạt xâm nhập qua thành và màng tế bào. Mật ựộ hạt sử dụng phải ựược ựiều chỉnh sao cho không làm tổn thương tế bào.
Những cây trồng ựã áp dụng thành công phương pháp bắn gen là ựậu tương, bông, ựu ựủ, ngô, lúa nước, lúa mì, mắa, cao lương, vv. Phương pháp này cũng ựược sử dụng ựể chuyển gen vào lạp thể và ti thể.
Phương pháp vi chắch: Dùng micropipet hay xylanh nhỏựể ựưa trực tiếp ADN vào tế bào trần.
4.3. Các tắnh trạng chủ yếu ựược cải tiến bằng con ựường chuyển gen
a. Tạo giống kháng sâu hai
Gen tạo ra ựộc tố có tác dụng diệt sâu, vắ dụ gen nội ựộc tố Bt từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis,
Gen tạo ra chất ức chế men phân giải protein làm hạn chế khả năng tiêu hoá thức ăn của sâu hại (chất ức chế trip-sin).
Phòng trừ sâu hại bằng hoá học không những tốn kém mà còn gây hậu quả xấu tới môi trường. Do ựó tạo ra các giống kháng sâu hại thông qua kỹ nghệ di truyền dựa vào gen ựộc tố Bt của vi khuẩn Bacillus thuringiensis là một tiến bộ quan trọng trong chọn giống kháng sâu. độc tố Bt là những tinh thể tạo ra trong quá trình tạo bào tử của vi khuẩn. Những protein tinh thể này có hoạt tắnh kháng một số loại côn trùng nhưng không ựộc với người.
Khi sâu hấp thụ tinh thể protein, ựộ pH cao trong ruột giữa phân các giải tinh thể và giải phóng protein. Vào giai ựoạn này protein chưa có hoạt tắnh ựộc, nhưng các men proteaza ựặc biệt trong dịch ruột phân huỷ protein chỉ còn lại bộ lõi kháng men proteaza, bộ lõi này hoàn toàn có hoạt tắnh. Bộ lõi này liên kết với chất nhận ựặc thù ở tế bào biểu mô nằm dọc theo ruột giữa và tự lồng vào màng nguyên sinh của tế bào. Tắch tụ các protein làm cho tế bào bị rò rỉ chất dinh dưỡng và chết. Côn trùng ngừng ăn và chết ựói trong vòng 24 tiếng ựồng hồ.
độc tố Bt có hoạt tắnh với nhiều loài sâu hại, ựặc biệt sâu thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera. Bt gen ựã ựược chuyển vào cây ựể phòng trừ sâu hại như phòng trừ Manduca sexta hại thuốc lá, sâ xanh hại cà chua và sâu xanh ựục quả bông Helicoverpa zea, v.v..
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Giáo trình Chọn giống cây trồngẦẦẦẦ.Ầ..ẦẦẦẦẦ.127 Một số cây trồng chuyển gen Bt ựược trồng trên quy mô thương mại là cà chua, bông, ngô, khoai tây (James và Krattiger, 1996; James, 1997).
Một protein nữa có khả năng diệt sâu là chất ức chế proteinaza tách chiết từ một cây nhiệt ựới, cây khoai môn khổng lồ. Cây này tạo ra một lượng chất ức chế cao trong củ. Chất ức chế tinh khiết có tác dụng làm giảm khả năng sinh trưởng của sâu non Heliothis armigera, do làm mất hoạt tắnh của men proteaza tiêu hoá nên chúng bị chết ựói. Tương tự, gen mã hoá chất ức chế tripsin của ựậu bò cũng ựược chuyển vào thuốc lá ựể phòng trừ sâu hại lá.
b. Tạo giống kháng virut