II, trong trường hợp bất bình thường chỉ có một sợi thoi ựược tạo thành và chỉ chia nhiễm sắc thể thành 2 nhóm, mỗi nhóm có 2n nhiễm sác thể Ha
3. Dung hợp tế bào trần
Trong các phương pháp chọn tạo giống truyền thống lai hữu tắnh là phương pháp cơ bản nhất ựể tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử. Tuy nhiên lai hữu tắnh chỉ thực hiện ựược giữa các cá thể trong một loài hay các loài có quan hệ thân thuộc. Lai giữa các loài có quan hệ xa nhau thường rất khó khăn và hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tắnh hữu dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguồn biến dị di truyền cần thiết cho việc cải lương cây trồng. Vì vậy một phương pháp mới ựược ựề xuất từ năm 1973(Keller và Melchers, 1973) ựể khắc phục hàng rào lai hữu tắnh giữa các loài có quan hệ họ hàng xa nhau là phương pháp dung hợp tế bào xô ma hay dung hợp tế bào trần.
Dung hợp tế bào trần là sự hợp nhất của các tế bào xô ma không có thành tế bào của các cá thể hoặc các loài khác nhau và sau ựó tái sinh cây lai từ các tế bào ựã dung hợp. Trong lai hữu tắnh, các tắnh trạng do ADN của cơ quan tử kiểm soát hoàn toàn giống cây mẹ vì không có sự tổ hợp các cơ quan tử của bố và mẹ. Trong dung hợp tế bào trần , ngoài khả năng dung hợp nhân, còn có khả năng xảy ra hỗn hợp tế bào chất, hình thành tổ hợp di truyền hoàn toàn mới. Ti thể và lạp thể của hai tế bào khác nhau có thể hợp nhất hoặc/và tái tổ hợp tạo ra một tế bào dị tế bào chất, gọi là cybrid. Như vậy, bằng con ựường lai xôma người ta có thể thu ựược tổ hợp mới của lạp thể hay/và ti thể và tương tác mới giữa nhân và tế bào chất.
Dung hợp tế bào trần là một quá trình nhiều giai ựoạn, bao gồm việc phân lập tế bào trần từ các loài khác nhau, dung hợp tế bào trần của hai loài khác nhau, giám ựịnh và nhân sản phẩm dung hợp và cuối cùng là tái sinh cây lai hữu dục từ sản phẩm dung hợp.
Trước khi tế bào xôma dung hợp phải loại bỏ thành tế bào ựể tạo ra tế bào trần. Tế bào thịt lá, rễ, thân mầm và các loại mô khác hoặc tế bào trong nuôi cấy huyền phù ựược xử lý với các enzym phân giải thành tế bào ựể thu nhận tế bào trần. Yếu tố hạn chế cơ bản trong việc ứng dụng rộng rài lai xôma là khó tái sinh cây từ protoplast và không có khả năng sử dụng một cách có chọn lọc các phần nhỏ genom của một loài ựế kết hợp với loài kia (Vasil, 1990).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Giáo trình Chọn giống cây trồngẦẦẦẦ.Ầ..ẦẦẦẦẦ.123 Lai xôma ựược sử dụng có hiệu quảựể kết hợp khả năng kháng các bệnh virut ở khoai tây từ các kiểu gen trong một loài cũng như từ các loài khác nhau (Wenzel, 1994). Lai xôma là một phương tiện có hiệu quảựẻ chuyển bất dục ựực tế bào chất và ựa dạng hoá nguồn bất dục trong việc tạo giống lai.
3.1. Dung hợp tế bào và sự phát triển của sản phẩm dung hợp
Tế bào thực vật tắch ựiện âm và ựẩy nhau cản trở quá trình dung hợp tự phát. Vì thế bước ựầu tiên ựể kết dắnh tế bào là làm cho chúng tiếp xúc với nhau, qua ựó tạo ra cầu nối tế bào chất giữa hai tế bào trần. Lần ựầu tiên vào năm 1973 Keller và Melchers ựã ựề xuất phương pháp dung hợp nhờ chất hoá học. Ngày nay phần lớn người ta sử dụng tác nhân dung hợp là hỗn hợp polyethylene glycol, nitrat canxi và dimethylfoxid.
Một phương pháp khác rất có hiệu quả, nhất là ựối với cây họ cà, là dung hợp bằng ựiện. Trước tiên tế bào trần ựược tiếp xúc với nhau thông qua trường ựiện xoay chiều không ựồng nhất giữa hai ựiện cực. Sau ựó quá trình dung hợp sẽ diễn ra thông qua xung ựiện của dòng ựiện một chiều có ựiện thế cao (500-2000 V/cm) trong khoảng thời gian cực ngắn (1 - 50 ộs - micro giây).
Trong sản phẩm dung hợp, sự dung hợp nhân thường không diễn ra ngay mà diễn ra trong vài ngày. Hai nhân cũng có thể hợp nhất vào thời ựiểm của lần phân bào nguyên nhiễm ựầu tiên. Nhiễm sắc thể của hai nhân cùng một lúc tạo ra ựĩa trung kỳ và dung hợp nhân xảy ra vào kỳ cuối. Cũng có thể một nhân phân chia nguyên nhiễm còn nhân thứ hai bị mất ựi tạo nên cây có kiểu nhân giống với một trong hai bố mẹ.
Trong quá trình phân bào sau khi dung hợp, các cơ quan tử trong tế bào dị nhân có thể phân ly, ựào thải hay tái tổ hợp tạo thành các dạng con lai khác nhau (Hình 8 - 1).
Nếu mục ựắch chỉ kết hợp nhân của một loài với toàn bộ tế bào chất của loài kia, người ta xử lý loài cho tế bào chất bằng tia X hoặc tia gamma và xử lý loài kia với hoá chất như iodoacetate hoặc iodoacetamide ựể loại trừ các cơ quan tử trước khi dung hợp. Phương pháp này gọi là phương pháp Ộthể cho Ở thể nhậnỢ (Galun và Aviv, 1986).
3.2. Chọn lọc sản phẩm dung hợp
Khi hỗn tế bào trần của hai loài bố mẹ trong môi trường dung hợp sẽ thu ựược 5 loại tế bào trần khác nhau: Những tế bào không dung hợp có kiểu nhân giống bố và mẹ; sản phẩm dung hợp hình thành do dung hợp tế bào trần của bố hoặc mẹ (sản phẩm dung hợp ựồng nhân); sản phẩm lai tế bào xô ma hình thành do dung hợp của tế bào trần bố và mẹ (sản phẩm dung hợp dị nhân). Tỉ lệ sản phẩm dung hợp hay con lai tế bào xô ma thường thấp phụ thuộc vào loài cây bố mẹ, tắnh tương hợp của chúng và phương pháp dung hợp. Một khó khăn trong việc phân lập con lai tế bào xô ma là phương tiện ựể giám ựịnh con lai (sản phẩm dung hợp) và tách chúng ra khỏi hỗn hợp các tế bào trần.
Về cơ bản có 3 phương pháp ựược sử dụng ựể tách sản phẩm dung hợp. Phương pháp thứ nhất dựa vào khả năng nhận biết tế bào lai ngay sau khi dung hợp. Tế bào trần của một bố mẹ không có chlorophyll (diệp lục) dung hợp với tế bào trần chứa chlorophyl của bố mẹ kia. Sản phẩm dung hợp (một nửa có màu xanh) có thể phân biệt và chọn lọc nhờ kắnh hiển vi. Cũng có thể chỉ thị tế bào trần bằng chất màu huỳnh quang rồi cho dung hợp và chọn tế bào lai bằng máy phân loại tế bào (Galbrath, 1984).
Phương pháp thứ hai dựa vào khả năng kháng kép của con lai xôma với các chất ựộc như chất kháng sinh (hygromycin, kanamycin) hoặc amino a xit tương ựồng. Bố và mẹ (hai loài chẳng hạn) chỉ có khả năng kháng một ựộc tố hay một axit amin tương ựồng. Sau
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Giáo trình Chọn giống cây trồngẦẦẦẦ.Ầ..ẦẦẦẦẦ.124 khi dung hợp tế bào trần của bố và mẹ có thể chọn lọc các tế bào lai dễ dàng vì chúng kháng ựược cả hai.
Phương pháp thứ ba là chọn lọc con lai xôma bằng cách so sánh sự biểu hiện kiểu hình của tắnh trạng ở trên cây hoàn chỉnh với các cây bố mẹ. Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng khi tỉ lệ dung hợp cao. Có thể thu ựược tỉ lệ con lai xôma cao bằng cách áp dụng phương pháp dung hợp nhờ ựiện. Bằng cách này Schilde-Rentschler và Ninnemann (1988) ựã thu ựược nhiều con lai xôma ở khoai tây.