Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng nhƣ các enzyme khác có thể dùng hai phƣơng pháp nuôi cấy : phƣơng pháp bề mặt và phƣơng pháp bề sâu. Phƣơng pháp bề mặt thƣờng dùng để nuôi cấy nấm mốc, phƣơng pháp bề sâu thƣờng dùng đối với vi khuẩn.
Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lƣợng
enzyme đƣợc tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thƣờng cao hơn rất nhiều so với phƣơng pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thƣờng là những nguyên liệu có nguồn gốc thực vật nhƣ cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận protease, ngƣời ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành nhƣ những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng bán rắn khi nuôi bằng phƣơng pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:
+ Nhiệt độ tăng rất chậm.
+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. + Thành phần dinh dƣỡng bắt đầu có sự thay đổi.
+ Khối môi trƣờng còn rời rạc.
+ Enzym mới bắt đầu đƣợc hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối không đƣợc đƣa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.
Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:
+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trƣờng, trong lòng môi trƣờng.
+ Môi trƣờng đƣợc kết lại khá chặt. + Độ ẩm môi trƣờng giảm dần.
+ Nhiệt độ môi trƣờng sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45o
C.
+ Các chất dinh dƣỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.
+ Các loại enzym đƣợc hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ đƣợc tạo ra nhiều hơn.
+ Lƣợng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải đƣợc thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29- 30oC là tốt nhất.
Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản nhƣ sau:
+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dƣỡng sẽ chậm lại.
+ Nhiệt độ của khối môi trƣờng giảm, do đó làm giảm lƣợng không khí môi trƣờng xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt độ nuôi duy trì ở 300C. Trong giai đoạn này, bào tử đƣợc hình thành nhiều do đó lƣợng enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết.
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này đƣợc gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng). Ngƣời ta thƣờng sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh.