để tủa enzyme protease.
Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết thu đƣợc đem đi tủa với các tác nhân tủa là muối (NH4)2SO4 và cồn 960
.
a) Tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ bão hòa khác nhau Bảng 3.3 : Khối lƣợng (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ.
Nồng độ (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) 50 55 60 65 70 75 Dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50 (NH4)2SO4 (g) 15,7 17,55 19,5 21,5 23,6 25,3
Tiến hành tủa trong điều kiện nhiệt độ thấp để đảm bảo hoạt tính enzyme không bị ảnh hƣởng và quá trình tủa xảy ra tốt.
Thể tích dịch enzyme và khối lƣợng muối (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ đƣợc sử dụng nhƣ bảng 3.3
Dịch chiết enzyme thô đƣợc cho vào becher đặt trong chậu nhỏ chứa đá vụn xung quanh. Tất cả đƣợc đặt trên máy khuấy từ.
Cho từ từ muối (NH4)2SO4 vào để muối có thời gian hòa tan trong dịch enzyme.
Tiếp tục khuấy từ thêm 15 phút.
Lấy dịch đi ly tâm 5000 vòng /phút trong 20 phút.
Thu tủa, hòa lại trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7. Cho dịch pha tủa vào lọ nhỏ, bảo quản 100C .
b) Tủa enzyme bằng ethanol 960 ở các tỷ lệ khác nhau Bảng 3.4 : Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ
Tỷ lệ dịch : ethanol 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6
Dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50
Ethanol (ml) 50 100 150 200 250 300
Để tránh làm biến tính protein, ethanol 960
phải đƣợc giữ lạnh trƣớc khi tiến hành tủa.
Thể tích dịch enzyme và thể tích cồntƣơng ứng với mỗi nồng độ đƣợc sử dụng nhƣ bảng 3.4
Lắc đều hỗn hợp, bảo quản lạnh trong một giờ. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút.
Bỏ dịch, thu tủa, hòa trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7. Cho dịch hòa tan tủa vào lọ nhỏ, bảo quản 100C.
c) Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa enzyme